免疫组化技术全程原理.PDFVIP

免疫组化技术全程原理 一、概念和常用方法介绍 1、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位 定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞 化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与 标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP） 等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分， 在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬 片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、 铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。 2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比， 间接法的灵敏度提高了许多。 3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵 白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等， 其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素 含量高的组织抗原检测。 4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素， 以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光 素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进 行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中 应用较广。 2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组 织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光 镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技 术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其 特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有 ABC 法、 SP 三步法、即用型二步法检测系统等。 3）免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能 迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二 抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内 的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高， 所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至 深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。 5、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 6、特点 1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化 从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA 显示淋巴 细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。 2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性 不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC 法或SP 三步法的出现，使抗体 稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应， 使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。 3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进 行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行 形态与功能相结合的研