VEGF与MMP―2在卵巢乳头状癌组织中表达特征及临床意义.docVIP

VEGF与MMP―2在卵巢乳头状癌组织中表达特征及临床意义 　　[摘 要] 目的：探讨卵巢乳头状癌组织中VEGF和MMP-2的表达特征，与卵巢乳头状癌发生侵袭、转移的相关性。方法：利用实时定量聚合酶链反应（QT-PCR ）、免疫组织化学染色法、Western blot法检测VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢组织、卵巢乳头状癌组织中的表达情况。结果：与正常卵巢组织相比，在卵巢乳头状癌组织中，VEGF/MMP-2基因和蛋白的表达量均明显升高，差异具有统计学意义（P0.05 ）。对比I-II期和III-IV期，在III-IV期VEGF/MMP-2基因和蛋白的表达也明显升高，差异具有统计学意义（P0.05 ）。结论：VEGF/MMP-2的高表达可能与卵巢乳头状癌的侵袭和转移密切相关。 　　[关键词] 卵巢乳头状癌；VEGF；MMP-2；侵袭和转移 　　中图分类号：R737.31 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）06-111-03 　　DOI：10.11876/mimt201606041 　　卵巢癌是女性患者中死亡率最高的一类恶性肿 　　瘤[1]，最常见的类型是卵巢乳头状癌。而卵巢癌高死亡率的主要原因[2]是70%左右的病例确诊时已有卵巢癌的浸润、盆腹腔的转移，无法手术和放疗。肿瘤发生转移和侵袭的两个重要环节就是新生血管形成与细胞外基质金属降解[3]。血管内皮生长因子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种多功能的细胞因子[4-5]，可以增强癌组织中内皮细胞的增生，促进新生血管的形成，同时增加肿瘤中血管的通透性，促进癌细胞进入血管的过程，提高其浸润和侵袭的能力。基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）是一种锌离子依赖的高度保守的内切蛋白水解酶家族，包括MMP1-MMP26等26个成员，能有效降解血管基底膜及细胞外基质的各种蛋白成分，从而破坏阻碍癌细胞侵袭的组织学屏障[6]。而MMP-2 [7]具有降解基膜Ⅳ型胶原的能力，一直是卵巢乳头状癌转移和浸润机制的研究热点。 　　本实验利用QT-PCR 法、免疫组织化学染色法、Western blot法检测VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢组织、卵巢乳头状癌组织中的表达情况，探讨其与卵巢乳头状癌侵袭、转移的关系，为下一步研究卵巢乳头状癌的早诊断早治疗及预后提供参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　VEGF兔多克隆抗体（武汉博士德有限公司）；MMP-2鼠单克隆抗体（武汉博士德有限公司）；柠檬酸盐修复液（福州迈新生物技术有限公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit试剂盒 （厦门艾德生物医药科技有限公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit（北京康为世纪生物科技有限公司）；DL1000Protein Marker （TaKaRa）；组织蛋白提取试剂盒（上海经科化学科技有限公司）；ECL显色试剂盒（Thermo） ；PBS缓冲液（pH7.2～7.4）（福州迈新生物技术有限公司）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 标本来源 收集我院从2013年1月至2015年6月期间具有完整的临床资料、经手术和病理检查诊断明确卵巢乳头状癌且术前均未行放、化疗的病例80例，正常卵巢组织49例。临床资料包括患者的姓名、年龄、有无浸润和转移等。卵巢乳头状癌病理诊断由两位高年资病理医师复阅切片，不一致病例由第三名医师进行评估，最后讨论达成共识。所有卵巢乳头状癌患者临床分期按国际妇产科联盟 （FIGO，1988 年）标准，其中I-II期15例，III-IV 期 65例。 　　1.2.2 总RNA提取，检测VEGF/MMP-2基因水平的表达情况 收集的正常卵巢组织、卵巢乳头状癌组织石蜡标本，用RNeasy FFPT试剂盒，按照说明书对每一份病例的石蜡标本分别进行总RNA提取。经反转体系得到cDNA，用QT-PCR方法检测VEGF/MMP-2基因的表达。QT-PCR条件：底物液12μL，H2O7.5μL ，引物（VEGF/MMP-2/actin）2μL模板2μL。 　　1.2.3 免疫组织化学染色法检测VEGF/MMP-2蛋白的表达情况 1）卵巢组织脱蜡和水化；2）抗原修复；3）免疫组织化学染色 ： 3%H2O2滴加在组织上，室温静置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；滴加一抗50μL， 4℃过夜；PBS洗3次各5min；滴加二抗50μL，37℃20min；PBS洗3