新型稀释液TCM199与甘油对牛精液冻存效果研究.docVIP

新型稀释液TCM199与甘油对牛精液冻存效果研究 　　摘要：通过对以TCM199为主要稀释剂，以甘油（GL）为冷冻保护剂的牛细管冻精的活力测定，筛选出了以TCM199、GL为稀释剂和冷冻保护剂的新型牛细管冻精制作配方。测定表明，以TCM199为主要稀释剂、GL为冷冻保护剂时，配方11的活力最高，达到0.60。 　　关键词：TCM199；甘油；细管冻精；活力 　　1 试验目的和要求 　　近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL），但是他们均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL强，所以现多用GL。本试验将利用TCM199作为能量和营养素来源，以GL作为冷冻保护剂，多梯度研究TCM199、GL作为稀释剂和冷冻保护剂保护精子的最优剂量，建立新型牛精液稀释和冷冻保存技术。 　　2 试验设备和要求 　　种公牛来自宁县兴旺牧业种牛场和甘肃省畜牧兽医研究所牛场。主要设备有人工采精器械、专用保温箱、吸管、冰箱、冷冻仪等。 　　3 试验方法和步骤 　　稀释液：按照设计配方、用量进行配制。 　　冷冻液：第一液为低浓度冷冻液，用于牛精液采集后的第一次稀释；第二液为高浓度冷冻液，用于第二次平衡稀释。 　　TCM199按照其说明浓度配制，并用酚红和NaOH进行pH标定。GL按照设计添加。 　　本试验针对以下3种处理实施，即测定不含冷冻保护剂时的精子冻存效果、添加TCM199但不含冷冻保护剂的精子冻存效果、以TCM199和GL为冷冻保护剂时的精子冻存效果。每个水平测定10次（重复），每次制作100枚细管冻精，从中随即抽检10枚，每次抽检测定均在制冻后24h进行。试验结果用spss统计分析。 　　4 试验结果 　　4.1 不含冷冻保护剂时的精子冻存效果 　　4.1.1 配方组合本试验系列配方中设计缺失TCM199、乙二醇（EG）和GL，仅仅用常规能量、抗生素构成稀释液，并进行冷冻保存和解冻观测。目的是评定和掌握牛精液的保存和抗冷冻打击的特性，为下一步试验提供参考数据。各组合配方详见表I。 　　本系列配方中用卵磷脂替代卵黄，添加tris以图进一步提高稀释液的缓冲能力，给精子提供良好的生存环境。 　　4.1.2 不合冷冻保护剂的细管冻精解冻效果按照试验设计设定的时间，对冻存24h后的试验冻精进行解冻。解冻时先准备好30℃水浴，将细管冻精在水浴中搅动2～3s解冻，用细管剪剪掉细管两端封口，分别在安排时段提取该管解冻精液抹片观察和记录，观察温度为25℃。 　　每组配方测定10枚细管冻精。解冻效果统计详见表2。 　　测定结果表明： 　　1）在不添加冷冻保护剂和稀释剂，但添加果糖等基础营养素的情况下，用超纯水稀释冷冻的牛精液也保持了适度的解冻活力。效果最好的为8号配方，在18h时的活力仍然维持在0.3的水平。 　　2）在不添加其它成分，仅仅用超纯水稀释的情况下，解冻冻精也有较高的活力，并且维持了较长时间。如10号配方，刚解冻后的活力有0.45，只是有效活力维持时间短。 　　3）活力衰减速率不一致。图1是表2资料的图示效果，各组在0～6h期间的活力下降最快，6～30h期间活力缓慢下降，30～48h期间的活力平稳下降。 　　4.2 添加TCM199但不含冷冻保护剂的细管冻精解冻效果 　　本项试验中，稀释液仅仅添加了不同剂量的TCM199，未添加GL和EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷冻保存过程中的效果。各组配方和效果测定分述如下。 　　4.2.1 配方组合添加TCM199但不含冷冻保护剂组的配方详见表3。在测定不同浓度TCM199的同时，在平行配方中还添加了Tris、柠檬酸钠、卵磷脂等。其中1、2、3、4、7号添加了Tris，5、6、8号添加了柠檬酸钠，9号添加了卵磷脂。 　　4.2.2 细管冻精解冻效果添加TCM199但不含冷冻保护剂组的解冻效果详见表4。 　　测定结果表明： 　　1）在只添加TCM199而未添加冷冻保护剂的情况下，冷冻解冻精液也保持了一定的活力。效果最好的为1号和5号配方，在18h时的活力仍然维持在0.2～0.3的水平。其它各组合在刚解冻时活力还较高，但持续时间短，活力下降速度快。 　　2）活力下降高峰期出现在0～6h阶段。各组下降速度基本一致，在图2中显示出相似的斜率。在6～24h阶段，各组合活力的下降速度趋缓，但在24～30h阶段又出现了活力迅速下降的现象，此后精子开始显著衰竭、残缺和死亡，失去了受精能力。 　　4.3 以TCM199和GL为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果 　　4.3.1 配方组合