莪术醇β―环糊精包合物对bel―7404肝癌细胞体外.docVIP

莪术醇β―环糊精包合物对Bel―7404肝癌细胞体外 莪术醇β―环糊精包合物对Bel―7404肝癌细胞体外 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，一旦确诊多数患者已为晚期，丧失手术治疗的最佳时机1]。尽管肝癌的综合治疗措施不断发展完善，但目前肝癌患者的预后极差。因此，开发治疗效果好、毒副作用小的抗肿瘤治疗药物，从而进一步提高肝癌的治疗效果，是临床和基础研究的重点。已有的大量研究表明，中医药在肿瘤治疗方面有着独特、高效、低毒的优势2]。莪术醇，又名姜黄环奥醇，是从传统中药莪术挥发油中提取出来的倍半萜类化合物。已有研究发现，莪术醇能够以剂量依赖的方式抑制肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞的增殖，表明莪术醇具有开发应用的前景3]。但莪术醇水溶性不佳，限制了其在临床与基础研究里的应用价值。如何提高其水溶性是当前研究的热点。 -环糊精是一种常用的药物辅料，具有良好的水溶性和增溶效果，其安全性已被广泛认可4]。 -环糊精的作用机制是通过将水溶性差的分子包入其疏水性空腔中，进而形成水溶性包合物，以提高药物的溶解性能，增加药物的生物利用度。我们之前的研究中制备的莪术醇与 -环糊精的包合物，较莪术醇的溶解度提高了10.3倍。有关体外抗肿瘤活性研究发现，莪术醇 -环糊精包合物可明显抑制食管癌细胞增殖并诱导凋亡5]。本研究在此基础上，于2016年6～12月进一步观察莪术醇 -环糊精包合物对人肝癌Bel-74细胞的抑制效果，并探讨其对细胞周期及其细胞周期调控基因表达的影响。 1 材料与方法 1.1 试剂来源 莪术醇（中国药品生物制品检定所）；TT（美国Invitrgen公司）； -环糊精（天津市光复精细化工研究所）；DE培养基（美国Gib公司）；兔抗人p单克隆抗体（美国ST公司）；兔抗人p27单克隆抗体（美国ST公司）；胎牛血清（美国Gib公司）；Annexin V-FIT-PI双染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）。 1.2 细胞培养 Bel-74人肝癌细胞株购于美国AT细胞库，细胞培养于含10%胎牛血清的DE培养基，在37℃、5%2条件下传代培养。取对数生长期状态良好的细胞进行以下实验。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 TT法测定肝癌细胞增殖情况 取对数生长期的细胞以104个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中。培养24 h后，分别加入终浓度为、、100 g/L莪术醇 -环糊精包合物培养液100 L，每组设置3个复孔。分别培养48 h与72 h后，每孔分别加入TT溶液 L（5 g/L），37℃继续培养4 h后结束培养。然后，每孔加入1 L DS，放于摇床振荡10 in，在酶标仪在570 n处测定每孔的吸光值（A）。实验重复3取平均值，并计算相应的生长抑制率。公式：生长抑制率（%）=（1-药物组A值/对照组A值） 100%。 1.3.2 细胞凋亡检测 根据细胞凋亡检测试剂盒说明，经莪术醇 -环糊精包合物处理48 h 后，胰酶消化，收集各组细胞。用PBS洗涤细胞2，分别加入1 Binding Buffer 0 L悬浮细胞，然后各加入5 L PI与5 L Annexin V-FIT充分混匀后，室温、静置15 in，流式细胞仪上检测。 1.3.3 细胞周期检测 Bel-74细胞经、、100 g/L莪术醇 -环糊精包合物处理48 h后，分别收集细胞，PBS洗涤细胞2，于4℃、70%乙醇固定24 h。PBS洗3后，加入Tris-Hl缓冲液，37℃避光孵育30 in，加入 g/L的PI进行细胞DNA染色。采用流式细胞仪检测细胞周期，分别计算处于各期的细胞所占比例。 1.3.4 estern blt法检测细胞周期蛋白的表达 Bel-74细胞经不同浓度莪术醇 -环糊精包合物处理48 h后，收集细胞，提取细胞总蛋白。取煮沸后的蛋白样品 g，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移至硝酸纤维素膜。室温封闭2 h，分别加入兔抗人p与p27单克隆抗体（1∶1000）4℃过夜。充分洗涤后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育2 h。采用增强化学发光法显色检测特异条带，并以GAPDH作为内参对照。 1.4 统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以（x s）表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，样本间两两比较采用SNK-q检验。P 0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 莪术醇 -环糊精包合物处理对细胞增殖能力的影响 经不同浓度莪术醇 -环糊精包合物处理Bel-74细胞48 h与72 h后，细胞增殖能力下降，见图1。、、100 g/L浓度的莪术醇 -环糊精包合物处理48 h后，Bel-74细胞的抑制率分别为（14.41 1.32）%，（27.38 1.05）%与（.75 1.49）%，