烟酰胺研究进展课件.pptVIP

微生物法生产烟酰胺实验进展报告 一.已完成实验方法1.菌体干重测定 从接上种子液开始，每8个小时取发酵液20ml，6000r／min离心20min，用PBS磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤3次，105℃干燥至恒重后称重，确定其生长曲线。 2.培养过程中PH曲线的确定 从接上种子液开始，每8个小时取一次样，用PH计测定PH值，确定其PH曲线。 3.培养过程中残糖量曲线的确定3.1 DNS法测定还原糖  DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖水解产生的多种还原糖体系中。 3.2 残糖量曲线的确定 从接上种子液开始，每8个小时取一次样，以DNS法测定残糖量，确定曲线。 4.烟腈水合酶酶活力的测定 9ml磷酸缓冲液和10ml的8％的烟腈，置于28℃的水浴环境，加入1ml发酵液，震荡反应5min，用5mol／L的HCl中止反应(HCL用量约是100μL)， 6000r／min离心20min，取上清液进行HPLC分析，测定烟酰胺含量算得酶活力。 6.最适碳源浓度的确定 经查阅大量文献，葡萄糖和酵母膏为该菌生长的最适碳、氮源，在含有l％酵母膏的发酵培养基中加入1％、1.5％、2%、2.5%、3%、3.5% 、4%的葡萄糖，测定不同浓度葡萄糖对腈水合酶活力的影响。7.最适氮源浓度的确定  同样，在确定发酵培养基中最适葡萄糖浓度的基础上，研究0.3％、0.5％、0.8%、1%、1.5%、2%的酵母膏对腈水合酶活力的影响，确定最适酵母膏的浓度。 8.培养条件的优化 pH对腈水合酶活性的影响 调整发酵培养基的pH分别为5.5、6、6.5、7、7.5、8、9，研究在不同的pH条件下菌体的生长及产酶情况。 9.腈水合酶的诱导9.1 金属离子对产酶的诱导与表达 经查阅大量资料表明腈水合酶为金属酶，而钴离子是本实验菌株产生的腈水合酶活性中心所必需的，钴离子的缺少将导致腈水合酶不能折叠成正常的活性酶，从而抑制腈水合酶的合成。因此考察4，6、8、10、12、14mg／L含不同浓度的钴离子的发酵培养基对酶活的影响。 9.2 脲对产酶的影响 在培养基中的酵母膏和脲除了作为细胞生长所必须的氮源外，脲还是诱导腈水合酶产生的一种必需诱导物，参与细胞生长的代谢并诱导腈水合酶的合成。因此考察0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%含不同浓度的脲的发酵培养基对产酶的影响。 结果诺卡氏菌菌落形态 菌体生长曲线 培养过程中PH的变化 培养过程中残糖量的变化 烟酰胺液相分析