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大连大学生命科学与技术学院 多肽与蛋白质类药物之胸腺激素的制备 吴冶红/生技091 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 胸腺位于纵膈腔上部、胸骨的后方；胸腺发生于胚胎第二个月，到出生后两年内，生长迅速，体积较大，到青春期仍然发育，青春期后萎缩。 胸腺是一个激素分泌器官，对免疫功能有多方面影响。 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 1966年戈尔茨坦(Goldstein)和怀特(White)首先从小牛胸腺组织中提取得到一种具有生物活性的物质，命名为胸腺素(thymocin)，随后进行了临床应用。 由于小牛胸腺来源有限，难于大量生产，而我国猪源比较丰富，以猪胸腺为原料，参考牛胸腺组分5的提取、纯化方法而制得的猪胸腺激素注射液，与国外的小牛激素作比较，活力相当，无明显不良反应。 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 表4-1 重要的胸腺激素制剂 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 1.胸腺激素 1）结构和性质 胸腺激素组分5是由在80℃热稳定的40~50种多肽组成的混合物，Mr1000~15000，pI3.5~9.5。 这些多肽共分三个区域： 分区 pI Α区 低于5.0的组分 β 5.0~7.0间的组分 γ 7.0以上的组分(组分很少) 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 2）生产工艺 ①工艺路线 上清液(组分2)绞碎 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 提取 取新鲜或冷冻胸腺，除去脂肪并绞碎后，加入3倍量生理盐水，于玻璃匀浆器中制成匀浆， 1400Xg离心后得提取液 (组分1)。 加热去杂蛋白 提取液80℃加热15min，以沉淀对热不稳定部分。离心去沉淀，得上清液(组分2) 。 ②工艺过程 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 沉淀 上清冷却至4 ℃，加入5倍体积的-10℃丙酮，过收集沉淀，干燥后得丙酮粉(组分3)。 分段盐析 将丙酮粉溶于pH7.0的磷酸盐缓冲液中，加硫酸铵至饱和度为0.25，离心除去沉淀，上清液(组分4)调pH为4.0，加硫酸铵至饱和度为0.50，得盐析物。 ②工艺过程 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 超滤 将盐析物溶于pH8.0的10mmol/L Tris-Hcl缓冲液中，超滤，取相对分子质量在15000以下的超滤液。 脱盐、干燥超滤液 经Sephadex G-25脱盐后，冷冻干燥得胸腺素(组分5)。 ②工艺过程 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 3）检验方法 活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%；相对分子质量15000以下。 4）作用与用途 胸腺激素为免疫调节剂，临床上主要用于以下方面的治疗： ①原发性和继发性免疫缺陷病，如反复上呼吸道感染等； ②自身免疫病，如肝炎、肾病、红斑狼疮、类风湿关节炎、重症肌无力等； ③变态反应性疾病，如支气管哮喘等； ④细胞免疫功能减退的中老年人疾病，并可抗衰老； ⑤肿瘤辅助治疗。 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 2.胸腺肽 1）结构与性质 胸腺肽(thymus peptides)是从冷冻的小牛(或猪、羊)胸腺中，经提取、部分热变性、超滤等工艺过程制备出的一种具高活力的混合肽类药物制剂。 胸腺肽中主要是Mr9600和7000左右的两类蛋白质或肽类，AA组成达15种，必须氨基酸含量高，还含有RNA0.2~0.3mg/mg制剂。 对热较稳定，加温80℃生物活性不降低。经蛋白酶水解作用，生物活性消失。 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 2）生产工艺 ①工艺路线 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 原料处理 取-20 ℃冷藏小牛胸腺，用无菌剪刀剪去脂肪、筋膜等非胸腺组织，再用冷无菌蒸馏水冲洗，置于灭菌绞肉机中绞碎。 部分热变性、离心、过滤 将冻结的胸腺匀浆融化后，置水浴上加热搅拌至80℃,保持5min，迅速降温，放置-20 ℃下冷藏2~3d。然后取出融化，以5000r/min,离心40min，温度2 ℃，收集上清，出去沉渣，用滤纸浆或微孔滤膜(0.22 μ m)减压抽滤，得澄清滤液。 ②工艺过程 2011/11/1 * 大连大学生命科学与技术学院 超滤、提纯、分装、冻干 将滤液用Mr截流值为10000以下的超滤膜进行超滤，收取Mr在10000以下的活性多肽，得精制液，置-20 ℃冷藏。经检验合格，加入3℅甘露醇作赋形剂，微孔滤膜除菌过滤、分装、冷冻干燥即得注射用胸腺肽。 ②工艺过程 2011/11/1 * 大连大学