放线菌新种分类鉴定课件.pptx

4312实验目的实验结果实验方法总结放线菌新种分离鉴定2011/12/281、实验目的 本实验通过对分离得到的放线菌新种从形态学、生理生化反应特征、和分子遗传分类学方面进行鉴定，证明其是以前从未发现的新种。2011/12/282、实验方法2.1 分离方法2.2 16SrRNA基因序列测定2.3 鉴定方法2011/12/282.1 分离方法近年来出现了胞外多糖胶与动孢溶液相结合的分离方法、再水化-离心 法、极高频辐射法、噬菌体定向分离法和蔗糖梯度离心法等用于稀有放线菌选择性分离的方法。2011/12/282.2 16SrRNA基因序列测定放线菌基因组的提取16SrRNA基因扩增胶回收连接转化测序研究2011/12/28A. 电镜取菌体后,3%戊二醛固定4h, 0.1M磷酸缓冲液漂洗。酒精梯度脱水，在30%、50％、70％、80%、100％依次脱水，其中100％酒精2次，每次10min。 乙酸异戊脂置换，50%一次，100%两次。Eiko公司XD-1型二氧化碳临界点干燥器干燥，Eiko公司IB-3型离子镀金仪喷金镀膜。 JEOL公司JSM-840扫描电镜观察。2011/12/28B. 培养特征参照国际链霉菌规划中有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征测定。所用培养基有:ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼脂，平板接种，28℃培养7，14，21，28d后分别观察并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶性色素。2011/12/28C. 生理生化实验生理生化特性的测定主要包括:pH、盐浓度和温度耐受性，明胶液化，淀粉水解，脲酶的产生，牛奶胨化和凝固，硝酸盐还原，H2S的产生，黑色素的产生，唯一碳、氮源利用等试验。2011/12/28a. pH、盐浓度和温度耐受性pH耐受实验在高氏一号培养基中分别加入pH缓冲液，空白培养基作阴性对照，28℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。温度耐受实验将菌株接种在高氏一号培养基上，分别在4℃、10 ℃ 、16 ℃ 、20 ℃ 、28℃、37℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。盐耐受实验高氏一号培养基内加入不同浓度的NaCI(l%，3%，5%，7%，10%，15%，20%)28℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。2011/12/28b. 明胶液化取明胶培养基试管作穿刺接种，另有两支不接种作空白对照。于28°C培养箱中培养。培养2、7、10、14和30天的试管，放入4°C冰箱或置于冷水中30min，然后进行观察。如明胶凝块部分或全部变为可流通的液体，则明胶水解阳性。如明胶凝块呈固体，则明胶水解阴性。若菌体未生长，可能是不能在明胶培养基上生长。2011/12/28c. 淀粉水解将菌株点种在淀粉琼脂平板上，待菌落生长良好时，在菌落周围滴加碘液检测淀粉水解酶活性的强弱。滴加碘液后培养皿背景呈蓝黑色,菌落四周若不变色，或移开菌落后滴加新碘液，菌落下得培养基仍不变色，表示淀粉水解阴性；若变成透明无色则为阳性，说明产生淀粉酶水解淀粉。2011/12/28d. 脲酶的产生有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。挑取18~24h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养1～4d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。e. 牛奶凝固与胨化将待测菌种接种在脱脂牛奶管中，观察牛奶凝固与胨化现象。若牛奶有凝块则为凝固，继续培养，凝固后有液体出现，进一步水解成液体，则为胨化，一般先凝固后胨化。2011/12/28f. 硝酸盐还原试验将待测菌种接在硝酸盐液体培养基中，置室温下培养，1、3、5d取样测定。每株菌作复本，另两管作对照。培养液中加入格里氏试剂A、B液各一滴，如呈现粉红色、玫瑰红色，表明硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则加1，2滴二苯胺试剂，如呈蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，硝酸盐还原属阴性，若不呈蓝色，表示硝酸盐和亚硝酸盐都已还原成其他物质，仍按阳性结果处理。2011/12/28g. H2S的产生某些细菌能分解含硫化合物如胱氨酸、甲硫氨酸而产生硫化氢气体，若于培养基中加入柠檬酸铁铵或醋酸铵，则与硫化氢作用生成硫化亚铁或硫化铅（黑色）沉淀。h. 黑色素的产生将供试菌株接种在酪氨酸培养基斜面管上，培养 7 d 和 14 d 观察结果，培养基被染成褐色或者黑色即说明该菌产生黑色素。2011/12/28i. 碳源利用和氮源利用（本实验利用BIOLOG板）碳源：D-葡萄糖，蔗糖，L-树胶醛糖，D-果糖，D-木糖，鼠李糖，I-肌醇，棉子糖，D-甘露醇，纤维素。不加碳源的基础培养基作为阴性对照。氮源