《第三章基因工程载体精简版》课件.pptVIP

第二节 基因工程载体 概述 质粒载体 噬菌体载体和粘粒载体 人工染色体 概述 什么是载体 所谓载体是指能够携带外源DNA片段进入受 体细胞并具有自我复制功能的核酸分子。 载体具备的基本条件 在宿主细胞内独立自我复制 具有合适的限制酶切位点 具有合适的选择标记基因 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 一 质粒载体 什么是质粒 质粒的生物学特性 质粒的分离与纯化 质粒载体的构建及类型 质粒载体的稳定性 什么是质粒(plasmid) 质粒是染色体外的能自我复制的环状核酸分子 。 不能独立的存在，只能随寄主细胞分裂而遗传，能独立进行复制，广泛的存在于原核生物或一些真核生物中 质粒的生物学特性 质粒的一般性质 质粒编码遗传表型 质粒的结合转移特性 质粒的不亲和性 质粒的复制特性 质粒的一般分子特性 细胞质粒大多是环形DNA分子 质粒可以稳定的存在于染色体外，在一定条件下也会整合到染色体上 质粒一般有三种构型：共价闭合环形DNA；开环DNA；线形DNA Open circle DNA 质粒编码遗传表型 由于质粒的存在赋予寄主细胞许多额外的表型 如:抗药性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的特征等 在基因克隆过程中应用较多的有抗药性特征、促进质粒转移的特征、产生大肠杆菌素的特征等，这些特征在重组子的筛选和表达载体的构建过程中得到充分的应用 质粒的复制类型 严紧型(stringent plasmid) 质粒复制受宿主染色体DNA严格控制， 拷贝数少，1-3个 松弛型（relaxed plasmid) 受宿主 控制比较松 拷贝数多，10-200个 培养液中加入氯霉素增加质粒产量 质粒的不亲和性（不相容性） 不亲和性（plasmid incompatibility ): 在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能在同一个宿主细胞系中稳定共存的现象。 在细胞的增殖过程中一种质粒逐渐被排斥、稀释掉，这样的两种质粒称为不亲和质粒。 质粒的不亲和性机理 质粒的转移特性 什么是质粒的转移？ 是指接合型质粒具有自主从一个细胞转移到另外一个细胞的特性 接合型与非接合型质粒 接合型：携带控制细菌配对和质粒结合 转 移的基因，能自我转移。 非接合型：不能自我转移 非接合型质粒 不能自我转移 只携带自主复制所必需的遗传信息 不具有细菌配对和质粒接合转移的基因 分子量小 属于松弛型 适合基因工程应用的质粒 质粒载体的构建 理想的质粒载体 分子量小，拷贝数高。 有多克隆位点（mcs) 有两种以上的选择标记基因 缺失mob基因和tra基因 重组质粒易导入宿主细胞 多克隆位点（mcs): multiple cloning site 是载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶位点的DNA片断。 质粒载体的构建 载体必须具备 复制必需区 选择标记基因 克隆位点 载体的类型 克隆质粒载体 表达质粒载体 多功能质粒载体 穿梭质粒载体 pBR322 胞内表达载体 分泌型表达载体 原核细胞表达载体 真核细胞表达载体 表达载体与克隆载体之区别 大肠杆菌表达载体具备: 强启动子 核糖体结合位点序列 强转录终止序列 信号肽编码序列 多功能载体 具有体外转录、克隆、基因表达、测序等 功能 穿梭载体(shuttle plasmid vector) 具有两种不同复制起点和筛选标记， 可在两种不同的宿主中存活复制的质粒载体 穿梭质粒类型 大肠杆菌—土壤农杆菌 大肠杆菌—酿酒酵母 大肠杆菌—枯草芽孢杆菌 大肠杆菌—动物细胞 二 噬菌体载体与粘粒载体 λ噬菌体载体 粘粒载体 λ噬菌体载体 λ噬菌体作为克隆载体的优越性 λ噬菌体的分子生物学概述 λ噬菌体载体的构建 λ噬菌体载体的类型 λ噬菌体的体外包装 λ噬菌体作为克隆载体的优越性 克隆容量大：噬菌体载体与质粒载体相比具有更强的容纳外源DNA的片段的能力。噬菌体载体最大可以克窿23Kb外源DNA 感染率高：每个噬菌体颗粒的感染率几乎是100%，而质粒DNA分子大约仅有0.1%的转化率 噬菌体基因组可以整合到寄主染色体上与寄主染色体一起复制 安全：噬菌体较质粒的宿主范围要窄的多，因而也就更加安全 λ噬菌体的生物学特性 λ噬菌体的生活周期 溶菌周期 溶源周期 烈性噬菌体 温和噬菌体 溶菌周期（裂解周期） λ噬菌体的分子生物学概述 基因组的结构 λ噬菌体线形的DNA分子的长度是48502bp 在λ噬菌体DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链末端,噬菌体进入菌体细胞后，粘末端配对形成双连