RNA提取和RT-PCR.pdfVIP

宝枫林 RNA 提取和RT-PCR 在做 Northern 等杂交实验、构建 cDNA 文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获 得 RNA 病毒基因时，会用到 RNA 提取和 RT-PCR 技术。 真核生物的基因组是 DNA，为什么不直接从 DNA PCR 得到我们需要的基因呢？因为真 核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元 隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。真核生物的 DNA 转录成为 RNA 之后，经过剪切和 拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的 mRNA，由 mRNA 再翻译成蛋白质。 所以，如果直接从真核生物的基因组 DNA 获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的 蛋白的思路是行不通的，因为获取的 DNA 里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并 表达出相应的蛋白，只能通过提取其 mRNA 并 RT-PCR 这条颇费周折的途径。 1 ．RNA 的提取 RNA 的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶 剂抽提 RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于 RNA 酶无处不在，随时可能 将 RNA 降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 1 ．1 分离高质量 RNA 成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆转录 酶的抑制剂，如 EDTA 或 SDS。RNA 的质量决定了你能够转录到 cDNA 上的序列信息量的最 大值。一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。 一般不必使用 oligo(dT)选择性分离 poly(A)+RNA。不管起始模板是总 RNA 还是 poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。另外，分离 poly(A)+RNA 会导致样品间 mRNA 丰度的波动 宝枫林 变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有 mRNA 时，poly(A)+RNA 会增 加检测的灵敏度。 1 ．2 RNA 提取的最大影响因素-RNA 酶 在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA。而实验失败的主要原因是 核糖核酸酶（RNA 酶）的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活， 如煮沸、高压灭菌等，RNA 酶催化的反应一般不需要辅助因子。因而 RNA 制剂中只要存在 少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程 中的降解，而所制备的 RNA 的纯度和完整 性又可直接影响 RNA 分析的结果，所以 RNA 的制备与分析操作难度极大。 在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源 性的 RNA 酶。外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其 它分子生物学实验中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃 制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源 性的 RNA 酶。 1 ．3 常用的 RNA 酶抑制剂 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的 活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。 *异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对 RNA 酶有强烈的变性作用。 *氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA 酶结合形成过渡 态类物质，几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。 宝枫林 *RNA 酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种 RNA 酶结合，使其失活。 *其它：SDS 、尿素、硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用。 1 ．4 防止 RNA 酶污染的措施、RNA 提取之前需要注意和准备的工作 *尽可能在实验室专门辟出 RNA 操作区，离心机、移液