第三章-生物材料的预处理、细胞破碎和液固分离.ppt

第三章 生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离 第一节 生物材料的预处理 第二节 细胞破碎 第三节 液-固分离 第一节 生物材料的预处理 一、确定预处理方法的依据 二、动物材料的预处理 三、细胞培养液的预处理 1. 生物活性物质存在方式与特点 —胞外： 由细胞产生再释放出来的 无活性的酶原需活化： 先活化再提取 先提取再活化 特点： 组成复杂，含量低 分离纯化难 防失活 2.后续操作的要求 一般要求：澄清、pH、一定的浓度 不同后续操作有不同的要求 离子交换---高价无机离子、澄清度等严格控制 溶剂萃取---蛋白质含量较低，防乳化 3.目的物稳定性 不稳定的：要防失活 青霉素---pH4.8-5.2，低温 蛋白类---高级结构 稳定的：可采用较剧烈的变性和处理条件，沉淀杂质蛋白 二、动物材料的预处理 绞肉机绞碎 匀浆和组织捣碎 三、细胞培养液的预处理 为什么需要预处理？ 可溶性粘胶状物质：杂蛋白、不溶性多糖等 粘度增加、影响提取操作 无机盐 在采用离子交换提取时，会影响树脂对生化物质的交换容量。 （1）加入凝聚剂 凝聚作用： 指在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。 胶体粒子稳定的原因： 带同种电荷静电排斥作用 表面水化作用，形成水化层 无机盐促凝聚作用： 加入相反电性电解质，中和胶体表面电荷，降低了双电层的排斥力 无机盐在水中的水化作用，破坏了胶粒水化层 影响凝聚作用的主要因素有无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量等。 通常培养液中细胞或菌体带负电荷，常采用高价阳离子促其凝固。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：Al3+Fe3+H+Ca2+Mg2+K+Na+Li+ 常用的凝聚剂有：Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等。 （2）加入絮凝剂 絮凝剂：有机高分子，易溶，链长，活性功能基团多 絮凝作用： 当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时，胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上，而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上，形成架桥联接，形成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。 影响因素： 分子量：大，效果好；过大，溶解度↓ 用量：低浓度增加用量有助架桥，浓度过高吸附饱和失去架桥作用，降低了效果。 pH：影响功能团电离度，电离度↑，链伸展， 效果↑ 操作条件： 搅拌：初期，快好；后期，会破坏絮凝团 （3）变性作用 天然蛋白质分子受到某些物理因素（如热、紫外线照射、高压和表面张力等）、化学因素（如有机溶剂、脲、胍、酸、碱等）影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变。 用途： 杂蛋白质变性沉淀析出 方法： 加热、大幅度改变pH，加有机溶剂、重金属盐或表面活性剂 （4）吸附 方法： — 加入吸附剂：活性碳除热原 — 加入反应剂：相互作用形成沉淀吸附蛋白质 四环素发酵液：黄血盐+硫酸锌 亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌体等黏附在其中而除去。 枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液： 氯化钙+磷酸盐 磷酸钙盐沉淀（吸附、助滤） （5）等电沉淀 — 常与其他方法合用 （6）加各种沉淀剂沉淀 — 沉淀剂与蛋白质形成复合物沉淀 2.多糖的去除 酶：转化为单糖 如发酵液中残留的淀粉：淀粉酶 粘多糖与一些阳离子表面活性剂如十六烷基溴化铵（CTAB）形成沉淀 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。 动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 一、机械法 原理：剪切力 1.高压匀浆器 原理：进入高压室的细胞悬浮液被强迫通过一个狭窄的小孔，产生液相剪切力引起细胞破碎。 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 2.高速珠磨机 原理：玻璃小珠与细胞悬液一起快速搅拌，研磨作用，细胞破碎。 3.超声波振荡器 原理：利用超声波的空穴作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 影响因素：超声波的声强、频率、破碎时间、介质的离子强度、pH、菌体的浓度和种类。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。超声破碎