Gateway系统构建双元表达载体-Bio-protocol.PDFVIP

/e1010201 DOI:10.21769/BioProtoc.1010201 Gateway 系统构建双元表达载体 Construction of Binary Expression Vector Using Gateway System 徐远涛，郑雄杰，曾云流，徐强* 园艺植物生物学教育部重点实验室，园艺林学学院，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：xuqiang@ 引用格式：徐远涛，郑雄杰，曾云流，徐强. (2018). Gateway 系统构建双元表达载体. Bio-101 e1010201. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010201. How to cite: Xu, Y. T., Zheng, X. J., Zeng, Y. L. and Xu, Q. (2018). Construction of dual expression vector using gateway system. Bio- 101 e1010201. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010201. (in Chinese) 实验原理：Gateway 技术是基于已研究的非常清楚的λ 嗜菌体位点特异重组系统 (attB x attP →attL x attR) 。BP 和LR 两个反应就构成了Gateway™技术。BP 反应利用一个 attB DNA 片段或表达克隆和一个attP 供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。 LR 反应是一个attL 入门克隆和一个attR 目的载体之间的重组反应。LR 反应用来在在 平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。Gateway 利用了位点特异重组， 所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦拥有一个入门克隆， 就可以多次使用它，转移目的基因到Gateway 改造过的各种表达载体。 实验目的：利用Gateway 技术构建双元表达载体，主要包括超量表达载体、干涉载体 以及启动子活性分析载体等，用来进行转基因功能验证。本实验以构建甜橙基因 Cs7g29500 的超量表达载体为例。 关键词：Gateway，载体构建，BP 反应，LR 反应 材料与试剂 1. 目的基因质粒 2. 目的基因正反向引物 3. BP 酶 4. LR 酶 5. 入门载体 (pDONR207，庆大霉素抗性) 6. Gateway 超量表达终载体 (pK7WG2D，壮观霉素抗性) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010201 DOI:10.21769/BioProtoc.1010201 7. Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (诺唯赞，catalog number: P505- d1) 8. 大肠杆菌Db3.0 感受态细胞 9. 其它材料试剂参见“PCR 扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018) 10. 60%甘油 (见溶液配方) 仪器设备 1. 低温水浴锅 2. 其他设备参见“PCR 扩增及克隆基因” (徐远涛和徐强, 2018) 实验步骤 1. 目的基因Cs7g29500 的克隆 1.1 根据基因Cs7g29500 的CDS 序列设计如下引物： attB1_Cs7g29500-ox-F: AAAAAGCAGGCTCCATGGCAATTTCAGCATTCAG AG attB2_Cs7g29500-ox-R: AGAAAGCTGGGTTTCATTTGAAACTGTCTCT Adapter attB1: GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT Adapter attB2: GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT 绿色背景序列为 Cs7g29500 的CDS 序列正反向引物，同时加了接头序列 (下 划线部分序列)。克隆其它任何基因时，一般截取CDS 起始密码子开始的20 个 碱基替换attB1_Cs7g29500-ox-F 引物中的绿色背景序列，截取CDS 终止密码 子往前20 个碱基