南海深海新颖低温脂肪酶的克隆表达及酶学性质鉴定.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（３）：４３５２ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 南海深海新颖低温脂肪酶的克隆、 表达及酶学性质鉴定 １，２ １，２ １ １ ３ １ 曹莹莹 　邓　盾 　张　云 　孙爱君 　夏方亮 　胡云峰 （１中国科学院南海海洋研究所　中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室　广东省海洋药物重点实验室　广州　５１０３０１） （２中国科学院大学　北京　１０００４９　３滨州市食品药品检验检测中心　滨州　２５６６１８） 摘要　从南海深海放线菌ＰｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌｉｓＳＣＳＩＯ０１２９９中克隆一个脂肪酶基因 ｌｉｐａｓｅＢ５。ｌｉｐａｓｅＢ５基 因片段大小为 ９７２ｂｐ，编码的蛋 白质具有 ３２３个氨基酸残基并与 Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｓｐ．ＨＨ１３０６２９０９中假定脂肪酶有９８％的同源性。以ｐＥＴ２８ａ（＋）为载体，将重组 质粒转化到 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中，实现 ｌｉｐａｓｅＢ５高效表达，并利用 ＮｉＮＴＡ亲和层析纯化 ｌｉｐａｓｅＢ５。ＬｉｐａｓｅＢ５最适反应底物为对硝基苯酚癸酸酯（ｐＮＰＤ），最适温度为３０℃，最适反应ｐＨ为 ７．５。ＬｉｐａｓｅＢ５催化ｐＮＰＤ水解反应的活性达到 １４０．１４Ｕ／ｍｇ，Ｖ 和Ｋ 分别为１０９．８ｍｏｌ／ｍｉｎ、 ｍａｘ ｍ μ ０．９７６ｍｍｏｌ／Ｌ，催化橄榄油的活力为３２．０１９７Ｕ／ｍｇ。ＬｉｐａｓｅＢ５在ｐＨ７．５～８．５保持良好的ｐＨ稳 定性；在１０～２０℃低温下保持较高的酶活力，在１０～４０℃内具有温度稳定性。ＬｉｐａｓｅＢ５对大部分 ＋ ２＋ 金属离子有很好的耐受性，低浓度的Ｌｉ、Ｍｇ 对该酶活性有促进作用。ＬｉｐａｓｅＢ５对高浓度的 ＮａＣｌ有很好的耐受性，在１００ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ存在下，酶活性大约保持在１０３％。ＬｉｐａｓｅＢ５对多种 短链醇类有机溶剂和表面活性剂有很好的耐受性，ＴｒｉｔｏｎＸ１００、Ｔｗｅｅｎ８０和Ｔｗｅｅｎ２０对ｌｉｐａｓｅＢ５ 酶有激活作用。 关键词　深海低温脂肪酶　金属离子耐受性　盐耐受性　有机溶剂耐受性　表面活性剂耐受性 中图分类号　Ｑ５５ 　　脂肪酶（ＥＣ３．１．１．３）又称为三酰基甘油酯水解 脂肪酶还被广泛应用于近代的新材料、医药、食品加 酶，能够将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。在动物、植 ［９１７］ 工、化学合成、生物能源等方面 。 物及微生物中广泛存在。脂肪酶属于 ／ 折叠水解酶 αβ 　　但目前工业上使用的脂肪酶基本都是中温酶，酶 超家族，催化中心由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸组成， 活性的最适温度一般在５０℃左右。低温脂肪酶的最适 ［１］ 少数脂肪酶由丝氨酸、谷氨酸和组氨酸组成 。脂肪 作用温度为２０～４０℃，在０℃左右仍有一定催化活性， 酶能催化水解、醇解、酯化和转酯化等多种化学反 低温脂肪酶同中温酶相比，具有高效、可低温下作用、 ［２４］ 应 ，是最重要的工业生物催化剂之一。例如，碱性 周期短、能耗低等优势，在酒类酿造、面包加工、肉类软 ［５］ 脂肪酶被广泛用于洗涤剂工业 、香料香精工业需求 化、食品添加剂、洗涤添加剂、油脂工