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CYP3A4基因原核表达质粒构建和诱导表达 　　摘 要：以质粒pCWNF14为模板，采用PCR技术扩增出CYP3A4基因，并将其接入pET-22b(+)、pET－28b(+)和pET－32a(+)载体中，经PCR测序鉴定后，转化Rosetta(DE3)2pLysS细菌，并用IPTG诱导表达，采用考马斯亮蓝染色的方法检测重组蛋白表达，3个表达重组质粒中，只有pET－32a(+)－CYP3A4可以表达目的蛋白；在低浓度IPTG(50μmol/L)诱导6h，所表达的CYP3A4蛋白约占细菌总蛋白的40％，且该蛋白不溶于8mol/L的尿素，而溶于去污剂10mmol/L 3－((3－cholamidopropyl)dimethylammonio propanesulfonic acid(CHAPS))和0.3％lauroyl sarcosine(SKL)，成功地使CYP3A4基因在原核系统中高效表达。 　　关键词：CYP3A4；大肠肝菌；表达 　　中图分类号：Q75 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007．7847(2007)01.0028-05 　　 　　CYP450蛋白是一类含血红素酶，它负责催化多种外源、内源性化合物的生物转化，例如：药物、致癌物等[1，2]，临床上大多数药物都需经CYP450代谢，所以一些候选药物在临床前需经CYP450代谢检测，尤其是近年来，新药的不断出现以及两种或两种以上药物同时应用对疗效的影响越来越受到重视，迫切需要应用体外系统能够快速、高通量检测对CYP450酶活性的影响，因此重组蛋白CYP450在药物代谢研究中具有重要的价值，CYP3A4是CYP450基因家族中一个重要的酶，它主要分布于肝脏、小肠，它涉及了许多药物的代谢过程，所以该蛋白异源性表达一直是研究的热点，本研究采用pET-32a(+)载体和Rosetta(DE3)2pLysS细菌建立了快速、高效表达CYP3A4的方法。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 主要试剂 　　大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)2 pLysS、XL-1为本室保存菌种；含有CYP3A4基因的质粒pCWNF14由Pro.Guengerich F惠赠，载体pET-22b(+)、pET-28b(+)和pET-32a(+)购自Merck公司(美国)；限制性内切酶BamH I、Xho I、Bgl，T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)；高保真Taq酶pfu购自Promega公司(美国)；胰化蛋白胨、酵母提取物为Oxoid公司(美国)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、IPTG(异丙基-β－D－硫代半乳糖苷)等购自Sigma公司(美国)；其它试剂为国产分析纯试剂。 　　 　　1.2 引物设计与合成 　　根据CYP3A4基因的序列设计引物，cyp3a4sense：5′CC GGATCCG ATGGCTCTGTFATT AGCAGTTTTTCTGGTGCTCCTC 3’，eyp3a4anti：5′TG CTCGAG TGCTCCACTTACGGTG CCA，由上海博亚公司合成，其中GGATCC与CTCGAG为BamH I和Xho I的酶切位点，前面的碱基为保护序列。 　　 　　1.3 CYP3A4基因扩增及克隆 　　取10ng pCWNF14质粒为模板，加入20μmol/L引物2.5μL，5ixL10×buffer，10mmol/LdNTP1μL，5U/μLpfu0.5μL，H2O 39 μL.PCR扩增条件为94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，30循环；72℃5 min.PCR产物经BamH I和Xho I酶切，切胶纯化基因片段，载体pET-22b(+)和pET-28b(+)经BamH I和Xho I酶切，而pET-32a(+)经Bgl和Xho I酶切，纯化载体酶切产物与CYP3A4基因片段连接，转化XL-1细菌，挑取菌落进行鉴定，并提取质粒测序。 　　 　　1.4 CYP3A4基因诱导表达 　　重组子pET-22b(+)-CYP3A4、pET-28b(+)-CYP3A4和pET-32a(+)-CYP3A4转化Rosetta(DE3)2pLysS，挑取单个菌落，接种于3 mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中培养过夜，取过夜培养物1mL接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基中培养2h，测定OD600值，约O.6h加入IPTG，终浓度为50μmol/L，继续培养，分别于3、6h取1mL菌液，以未加IPTG诱导的各重组子细菌培养物为对照，重组子pET-28b(+)－CYP3A4采用的培养基所含的为卡那霉素(50mg/L)。 　　 　　1.5 重组蛋白检测