大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的试验研究.PDFVIP

2011;31(7) 南方医科大学学报（J South Med Univ ） ·1131 · ·基础研究· 大鼠Atoh 1基因真核表达载体的构建及转染293T 细胞的实验研究 郑国玺，祝 康，朱 珠，侯 瑾，韦俊荣，许 珉 西安交通大学医学院第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院，陕西 西安 710004 摘要：目的利用基因工程方法克隆SD 大鼠Atoh 1基因CDS ，构建大鼠核转录因子Atoh 1 的真核表达载体并在真核细胞 中表达。方法 从SD 大鼠结肠粘膜提取总RNA ，采用逆转录PCR 法扩增Atoh 1基因CDS 区序列并TA 克隆至PMD- 19T 载体中。测序鉴定后将Atoh 1基因连接于含有EGFP 和内部核糖体转入位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核细 胞表达载体pIRES2-EGFP 中，对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后，以脂质体介导法转染至293T 细胞，荧光显微镜、 PT-PCR 和Western blot 检测其在293T 细胞中的表达。结果 扩增得到大鼠Atoh 1 CDS 区长1056 bp ，编码351个氨基酸， 与GeneBank 公布的参考序列对比，有两处碱基发生突变，但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致，两处碱基 应为单核苷酸多态性（SNP），突变为无义突变，不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh 1 已正确地克隆到真核表达 载体pIRES2-EGFP 中，转染293T 细胞48 h 后，荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达，PT-PCR 和Western blot 证实Atoh 1 的mRNA 和蛋白能在293T 细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh 1 -IRES2-EGFP ，并在293T 细胞中成 功表达，为进一步研究Atoh 1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。 关键词：感音神经性耳聋；Atoh 1；基因克隆；真核表达载体 中图分类号：R764.43 文献标志码：A 文章编号：1673-4254（2011）07-1131-07 Construction of a recombinant eukaryotic vector of Atoh1 and its expression in 293-T cells ZHENG Guo-xi, ZHU Kang, ZHU Zhu, HOU Jin, WEI Jun-rong, XU Min Department of Otorhinolaryngology, Second Affiliated Hospital, Medical School of Xi ’an Jiaotong University, Xi ’an 710004, China Abstract: Objective To clone the coding sequence of Atoh1 cDNA from SD rat and construct a eukaryotic expression vector for its expression in eukaryotic cells. Methods The total RNA was extracted from colonic mucosa of SD rats and the double-stranded cDNA of Atoh1 was amplified using RT-PCR. The cDNA coding sequence was then cloned into PMD-19T vector followed by sequence analysis. The digested fragment, after purification, was linked into the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP containing the EGFP gene and the internal ribosomes