HLADQB1等位基因和广东汉族人群系统性红斑狼疮相关性研究.docVIP

HLADQB1等位基因和广东汉族人群系统性红斑狼疮相关性研究 　　【摘要】 应用微量序列特异性引物聚合酶链反应技术（Micro-PCR-SSP），探讨我国广东籍汉族人群系统性红斑狼疮（SLE）与HLA-DQB1基因的相关性。对38例SLE患者和110例正常对照者的血样进行分析，实验表明，SLE患者DQB1*0601等位基因频率显著升高（RR＝2．19，P=0．0055），可能是易感基因，而DQB1*0301与DQB1*0401基因频率则显著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．0001; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．0409），可能为保护基因。? 　　【关键词】HLA-DQB1等位基因；系统性红班狼疮 　　? 　　系统性红斑狼疮（SLE）发病机制极为复杂，常累及多个脏器，发病有一定的遗传倾向。人类白细胞抗原系统（human leukocyte antigens，HLA）是一组组成和结构都有非常复杂的基因复合体，HLA最主要的特点是具有高度多态性，特别是在HLA-Ⅱ类基因的第二外显子区，这种多态性更为明显。与SLE有关的主要是HLA-Ⅱ类基因[1]，HLA-Ⅱ类基因座在HLA-D区，包括HLA-DQ、DR、DP三个亚区，已知HLA-DQ的多态性与SLE自身抗体的产生关系最密切[2]。本中心实验室应用微量序列特异性引物聚合酶链反应技术（Micro-PCR-SSP）从分子遗传学角度，探讨HLA-DQB1与广东汉族人SLE患者的遗传易感性关系。? 　　1 材料和方法? 　　1．1 研究对象 拟选广东籍汉族SLE患者38例，SLE患者均符合1992年美国风湿病协会修订的诊断标准。选取连续三代均为广东籍无亲缘关系的健康者100例作为对照组，与患者无血缘关系。? 　　1．2 标本采集 抽取SLE患者与正常人静脉血各2 ml，ACD-B抗凝。? 　　1．3 试剂? 　　1．3．1 引物设计 按文献[3]合成28条核苷酸链，组成20对引物。? 　　1．3．2 Taq酶购自上海生工生物工程技术有限公司。? 　　1．3．3 DNA抽提试剂盒购自德国QIAGEN公司。? 　　1．4 基因组DNA的制备 取2 ml ACD-B抗凝全血3000转/min，离心10 min，吸取200 μl白膜层加入1．5 ml离心管中，加入25 μl QIAGEN蛋白酶K和200 μl AL缓冲液，混匀15 s，70℃孵育10 min，然后加入200 μl无水乙醇混匀，将上述混合液转至DNA亲和柱上，离心10 000转/min 1 min，去除滤过液，在柱上加入500 μl AW1缓冲液，离心1 min，再加入AW2缓冲液，重复洗涤一次，然后加入200 μl的AE缓冲液，室温孵育5 min，最后离心1 min洗脱DNA，并测定DNA的浓度和纯度。? 　　1．5 DNA扩增在SSP-PCR反应体系中，每一DNA均作20支反应管，每管反应液50 μl，含25 μmol/L dNTP,10×PCR缓冲液1．5 μl，MgCL 21．5 mmol/L，Taq酶1 U，模板DNA 50~100 ng，等位基因专一性引物各0．25 μmol/L。PCR循环参数为95℃1 min预变性，然后94℃ 30 s、60℃30 s、72℃ 60 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。扩增结束后，将扩增产物转至2%琼脂糖凝胶微量胶内，125伏电压电泳15 min，然后在凝胶一次性成像仪上观察并拍照。? 　　1．6 统计学分析 用直接计数法计算基因频率。用Fisher精确法统计P值和相对危险度（RR）。显著检验水平为0．05。? 　　 　　 　　2 结果? 　　从表中可以看出，与正常对照组相比，SLE患者组中DQB1*0601等位基因频率显著升高（RR＝2．19，P=0．005 5），而DQB1*0301与DQB1*0401基因频率则显著降低（ DQB1*0301，RR＝0．1253，P=0．000 1; DQB1*0401，RR＝0，P＝0．040 9）。? 　　3 讨论? 　　人类主要组织相容性复合体(MHC)含128个功能基因，其中39．8%的基因和免疫系统有关，因此39．8%基因可能与许多免疫疾病的发生直接或者间接相关[4]。近年来国外的许多研究资料表明，在遗传因素方面，SLE与HLA基因的遗传易感性关系存在着种族和人群差异的影响，尤其DQ位点的作用引人注目。笔者通过应用PCR-SSP技术获得了广东正常人群和SLE患者基因频率，结果发现SLE患者DQB1*0601等位基因频率较正常人显著升高，提示DQB1*0601可能是SLE的易感基因，而正常人DQB1*0301与DQB1*0401的等位基因频率显著升高。在高加索