多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子结构和功能分析.docVIP

多重耐药革兰阴性杆菌Ⅰ类整合子结构和功能分析 　　[摘要] 目的 探索Ⅰ类整合子在多重耐药的革兰阴性杆菌中的功能作用，并对其基因结构进行研究，为阐明革兰阴性杆菌的耐药机制和抑制耐药性的产生提供理论依据。 方法 选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株，其中铜绿假单胞菌40株，鲍曼不动杆菌40株，使用K-B纸片法和双纸片协同实验对细菌的耐药性和超广谱β-内酰胺酶（ELSBs）的产生情况进行考察。对耐药且产ELSBs的细菌进行筛选，使用聚合酶链式反应（PCR）扩增实验、电泳法、整合酶Sourthen杂交实验对耐药细菌体内的Ⅰ类整合子存在情况、整合子基因结构、基因位置进行考察。 结果 药敏结果显示，40株铜绿假单胞菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为27株，40株鲍曼不动杆菌中多重耐药且产ELSBs的菌株为28株。对多耐药且产ELSBs的菌株通过PCR扩增实验进行的Ⅰ类整合子存在情况的考察结果显示，40株鲍曼不动杆菌和40株铜绿假单胞菌中Ⅰ类整合子的阳性率分别为57.5%和55.0%。Ⅰ类整合子的保守区和可变区PCR扩增与测序分析结果显示，保守区内含有qaeE△1-F和sul 1-B这两种特征性基因片段，可变区内以长度为0.15、1.00、2.00、2.30 kb的基因片段出现频率最高，0.15 kb含有保守区内基因结果，其它基因片段依次为aadA、aaeA4、catB8这3种基因盒。 结论 Ⅰ类整合子与革兰氏阴性杆菌耐药性的产生有着密切的关系，qaeE△1-F和sul 1-B为Ⅰ类整合子基因保守区的特征性片段，两者同时出现则可确证该细菌体内含有Ⅰ类整合子。Ⅰ类整合子基因可变区内含有aadA、aaeA4、catB8三种出现频率最高的基因盒且长短为0.15 kb的基因片段含有保守区的基因结构，这3种基因盒和保守区基因片段的存在是导致细菌间耐药性平行转移的重要因素。 　　[关键词] 多重耐药性；革兰氏阴性杆菌；Ⅰ类整合子；基因扩增 　　[中图分类号] R446.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2013）04（c）-0091-04 　　抗生素作为治疗人类感染性疾病的主要药物，其临床有效性是人类健康的重要保障。但是目前因抗生素的滥用和使用不当导致出现大量的耐药细菌，细菌耐药性的存在大大降低了抗生素的临床治疗效果并大幅增加了疾病治疗的成本[1]。但是，因抗生素的研发周期较长，抗生素更新的速度远低于细菌耐药性产生的速度。目前，我国已成为当今世界抗生素滥用程度和使用量最大的国家[2]，并且每年都在大幅增加。在感染性疾病中，因革兰阴性杆菌[3]所致的疾病占主要比例，抑制革兰阴性杆菌耐药性的产生对于感染性疾病的治疗具有重要的临床意义。国外早在20世纪80年代末即对细菌耐药基因的水平传播进行了研究，并通过实验证细菌耐药基因的传播与一种称为整合子的移动基因原件有着密切的关系[4]。关于整合子，目前研究证实其为一类可特异性识别并捕获移动基因盒的基因重组系统，能够通过整合耐药性相关的基因盒而使细菌的耐药性在细菌间水平传播[5]。研究发现，在细菌中目前主要存在Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类这3种整合子[6]，且以Ⅰ类整合子的存在比例最大，该类整合子与细菌特别是革兰阴性杆菌的多重耐药性的产生有密切关系。探明Ⅰ类整合子在革兰阴性杆菌中的功能和其结构对于抑制细菌耐药性的产生、提高抗生素的治疗效果而言是一项重要的工作。本研究以多重耐药铜绿假单胞菌和多耐药的鲍曼不动杆菌为研究对象，对其体内的Ⅰ类整合子的功能和结构进行了研究分析，现报道如下： 　　1 材料与方法 　　1.1 菌株来源 　　选择温岭市妇幼保健院2009年7月～2011年10月的多重耐药革兰阴性杆菌80株，其中铜绿假单胞菌40株，鲍曼不动杆菌40株。分离自呼吸科病房15株（铜绿假单胞菌7株，鲍曼不动杆菌8株），肾内科病房12株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌7株），消化科病房12株（铜绿假单胞菌9株，鲍曼不动杆菌3株），肿瘤科病房14株（铜绿假单胞菌6株，鲍曼不动杆菌8株），泌尿外科病房13株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌8株），血液科病房14株（铜绿假单胞菌5株，鲍曼不动杆菌9株）。40株铜绿假单胞菌中，分离于血液标本5株，痰标本17株，尿标本9株，脓标本6株、其他3株；40株鲍曼不动杆菌中，分离于尿标本11株、痰标本7株、血液标本12株、脓标本7株，其他3株。细菌的筛选与纯化均由全自动微生物鉴定系统完成（法国梅里埃公司，VITEC-2 COMPACT），细菌纯度一致，无其他杂菌，对实验结果无影响。 　　1.2 试剂与仪器 　　主要试剂：琼脂（天跟生化公司），溴化乙锭（天跟生化公司），限制性内切酶 HinfⅠ（大连宝生物工程有限公司），