基于比速率及代谢流的黑曲霉突变株和野生株分析.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（８）：３５４０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 基于比速率及代谢流的黑曲霉突变株和野生株分析  陈香粉　鲁洪中　唐文俊　唐　寅 　储　炬　庄英萍　张嗣良 （华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室　上海　２００２３７） 摘要　黑曲霉具备优异的外源蛋白表达和分泌能力，从而被广泛应用于工业酶制剂的生产。通 过研究黑曲霉突变株和野生株在相同培养条件下生理参数和代谢流的差异，确定了黑曲霉合成 糖化酶过程中的限制性因素。宏观动力学分析发现，较之野生株，突变株具有较高的最大比生长 速率，并且副产物得率降低了９０％，底物利用率提高了近３０％，表明突变株与野生株在碳源分配 和产物转化率上具有明显的差异。利用流平衡分析（ＦＢＡ）计算胞内代谢通量分布，发现还原力 和核糖的供应水平是限制菌体合成的主要因素，而前体氨基酸是合成糖化酶最主要的限制性因 素。这些研究结果为后续发酵工艺优化和菌株基因改造提供了有益的思路。 关键词　黑曲霉　糖化酶　代谢通量分析　副产物 中图分类号　Ｑ９３６ 　　糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶，系统名称为 １，４葡 关键位点已经成为研究的热点［９１１］。 α 聚糖葡萄糖苷水解酶，在发酵工业中大量用作淀粉糖 　　本文研究了相同培养条件下黑曲霉野生株和突变 化剂。作为合成糖化酶的常用菌株，黑曲霉生产糖化 株发酵过程中生理参数的差异，并利用流平衡分析的 ［１］ 方法进一步分析造成两株菌表型差异的原因，确定了 酶的最高产量可达２０ｇ／Ｌ 。由于工业过程中糖化酶 的大量使用导致它的生产依旧处于供不应求的状态。 黑曲霉合成糖化酶过程中主要的限制因素，为今后的 　　目前代谢工程技术已经广泛应用于菌株的改造， 基因定向改造提供依据。 但是由于细胞代谢活动的复杂性，基因改造往往达不 １　 材料与方法 到预期的效果，通过目标产物合成过程中限制性瓶颈 的研究来实现靶向性的基因改造。流平衡分析（ｆｌｕｘ １．１　材　料 ｂａｌａｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＦＢＡ）属于代谢流分析的范畴，它可以 １．１．１　菌株　黑曲霉野生株 ＣＢＳ５１３．８８及突变株 ［２３］ ? ＧＡＭ１５。 用来预测代谢工程的基因靶标 。在代谢稳态和同 位素稳态的条件下，ＦＢＡ通过模拟菌体胞内的代谢通 １．１．２　培养基组分　固体培养基：固体土豆培养基 量分布，为目标产物合成过程中代谢瓶颈的发现奠定 （ＣＭ０１３９，Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）；发酵培养基：４５．１ｇ／ＬＧｌｕｃｏｓｅ· ［４］ ［５］ ［６］ ＨＯ，１０ｇ／ＬＭａｌｔｏｓｅＤｅｘｔｒｉｎ，０．１ｇ／ＬＣａＣｌ·２ＨＯ， 了基础 。Ｐｌｕｓｃｈｋｅｌｌ等 和Ｎｉｅｌｓｅｎ等 利用代谢控 ２ ２ ２ 制分析方法对青霉素Ｖ的生物合成路径进行研究，发 １．０ｇ／ＬＭｇＳＯ ·７ＨＯ，２ｇ／Ｌｃｒｉｔｉｃａｃｉｄ，０．３ｇ／Ｌ ４ ２ 现了青霉素Ｖ合成的限制性因素，为产黄青霉的菌株 （ＮＨ）ＳＯ，３ｇ／ＬＫＨＰＯ，１．０５ｇ／ＬＮａＨＰＯ ·ＨＯ， ４ ２ ４ ２ ４ ２