蛋白质工程试验项目-生物学试验教学中心.DOCVIP

蛋白质工程试验项目 实验一 聚丙烯酰胺凝胶电泳制备 实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳 实验三 豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察 实验四 含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制 实验五 BL21-ERAF17 目的蛋白基因的检测 实验六 目的蛋白ERAF17的诱导表达及蛋白处理 实验七 目的蛋白质电泳、染色、脱色及对比观察 实验一 聚丙烯酰胺凝胶电泳配制 【实验目的】：通过本实验熟悉聚丙烯酰胺凝胶的配置技术。 【实验原理】：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂TEMED和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，可以根据蛋白质带电荷、分子量大小等将蛋白质分离，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE。 【实验设备及药品】：垂直板凝胶电泳设备、移液器、烧杯、单体丙烯酰胺、交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺、加速剂TEMED和催化剂过硫酸铵。 【实验步骤】 1．不同体积15% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液配制 溶液成分 总体积 5ml 总体积 10ml 总体积 15ml 总体积 20ml 总体积 25ml 总体积 30ml 15% 水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml 30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml 1.5MTris(pH 8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml 10% SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml 10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml 2．迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层无水乙醇（异丙醇或水）（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。 3．分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。 4 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备5% 浓缩胶溶液4ml，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。 不同体积5%聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶制备 溶液成分 总体积 3ml 总体积 4ml 总体积 5ml 总体积 6ml 总体积 8ml 水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml 30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml 1M Tris(pH 6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml 10% SDS 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml 10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml TEMED 0.003ml 0.004ml 0.005ml 0.006ml 0.008ml 5. 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶, 立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。 实验二 豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳 【实验目的】：学习植物可溶性总蛋白提取原理及方法，熟悉蛋白质电泳操作步骤，熟悉蛋白质分离的原理。 【实验原理】：多数蛋白质都溶于水、盐溶液或有机溶液，分离纯化某一蛋白质首先要求把蛋白质从组织或细胞以溶解的形态释放出来，并保持原来的天然状态。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中由于SDS带有大量的负电荷，由于不同的SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于蛋白质分子量，因此经过一段时间电泳后蛋白质混合物会按其分子量大小分离。 【实验设备及药品】：高速离心机、移液器、蛋白质电泳仪、微量移液器、恒温水浴锅、Tris-甘氨酸电极缓冲液、液氮、豌豆苗。 NaCl NaCl 8.0 g 0.8 g KCl 0.2 g 0.02 g Na2HPO4 1.44 g 0.144 g KH2PO4 0.24 g 0.024 g ddH2O定容 1000 ml 100 ml 定容后调节pH值 (7.4)。 3．将PBS溶液置于4度预冷。 4．将研钵，离心管，药匙用液氮预冷。 5. 取各样品叶片分别约100 mg，注意取材后要立即称量。 6. 将叶片放入研钵，加入液氮进行充分研磨。 7. 将研磨所得的粉末转移到 Eppendorf管中,加入冰冷的PBS溶液200μl, 颠倒混匀, 立即置于冰上静止3-4小时（使其充分溶解）。 8.1200