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梅花氧―甲基转移酶基因克隆和器官表达分析 　　摘要：以梅花的花朵为材料，采用RT-PCR与RACE相结合的方法，从“三轮玉蝶”梅花的花朵中克隆到1个全长1 322 bp的氧-甲基转移酶cDNA，命名为PmOMT，该基因编码377个氨基酸的开放性阅读框，具有植物氧-甲基转移酶基因典型的3个保守基序，与月季（R. chinensis var. spontanea）的甲基（异）丁香酚转移酶基因RcOMT1具有较高的同源性。构建系统发育进化树结果表明，PmOMT与RcOMT1亲缘关系最近，同属COMTs类基因。荧光定量PCR分析发现，PmOMT基因的相对表达量与甲基丁香酚色谱峰面积的变化趋势相似，推测该基因可能参与甲基丁子香酚的生物合成。 　　关键词：梅花；氧-甲基转移酶；基因克隆；器官；丁子香酚 　　中图分类号： S685.170.1 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0022-04 　　梅花（Prunus mume）是我国的传统名花，具有怡人香气，释放大量包括（异）丁香酚和甲基（异）丁香酚在内的苯基/苯丙烷类芳香族化合物[1]，这些芳香族化合物是植物花香的重要成分，并作为信号因子引诱蛾类完成授粉[2]。氧-甲基转移酶（O-methyltransferases，OMTs）是植物酚类衍生物形成过程中重要的一类酶，会将腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-l-methionine）的甲基转移到酚类化合物的羟基上，形成类黄酮化合物、木质素和花香化合物等3类酚类衍生物[3-5]，这些酚类衍生物在植物生长发育以及与环境的信息交流方面发挥着重要作用。本研究在前期梅花花香成分研究的基础上，以“三轮玉蝶”梅花的花朵为材料，对梅花氧-甲基转移酶全长基因进行克隆，应用荧光定量PCR技术分析该基因在梅花不同器官中的表达，旨在为进一步研究梅花花香基因功能及其形成的分子机制提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　三轮玉蝶梅花种植于北京林业大学校园内，取梅花开花指数2～3级的花朵[1]、根、茎、叶片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花萼，用锡箔纸包好，液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱，备用。RNA Easy Kit试剂盒，购自北京盖宁公司；普通cDNA第一链的合成试剂盒，购自MBI公司；pGM-T克隆试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA Marker、Escherichia coli TOP10感受态细胞，均购自北京天根生物公司；Go Taq Flexi DNA Polymerase、Pfu DNA Polymerase、DNaseⅠ，购自Promega公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit，购自TaKaRa公司；扩增引物，由北京奥科生物公司合成；SYBR Green I 染料，Invitrogen公司生产；分析纯级的其他试剂，均为国产。用于提取RNA的溶液，均用0.1% DEPC处理的水配制；离心管、枪头等塑料制品，均用0.1% DEPC浸泡过夜，高压灭菌，备用。 　　1.2 梅花PmOMT基因cDNA全长的获得 　　按照RNA Easy spin kit试剂盒的说明提取花朵总RNA，用DNase Ⅰ酶去除RNA中的痕量DNA；用M-MLV反转录酶对1 μg总RNA进行反转录，获得第一链cDNA；根据GenBank中检索到的仙女扇（异）甲基丁香酚（登录号：U86760）和月季花氧位甲基转移酶基因（登录号：AB086103）核苷酸和氨基酸保守序列，设计1对兼并引物为OMT1：5′-STTGTKGATGTTGGGGGBGGGCTAGG-3′和OMT2：5′ -ACAACWATBACYTTBCCATTRTCVGG-3′，以cDNA第一链作为模板进行PCR扩增；根据获得的保守序列，设计3′-RACE特异引物为OMT3：5′-AGGGTATCAATTTCGACTTGCC-3′，按3′-Full RACE Core Set Ver.2.0说明书进行操作，获得3′端序列；将保守区序列和3′-RACE序列进行拼接，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书设计2个特异引物为OMT4：5′-GCTTTAGGCAGTGCTCATCGCTC-3′和OMT5：5′-CACTCCAGGATAGGAAGGGGCAT-3′，分别与试剂盒中的引物进行扩增，获得5′端序列；所有扩增产物经回收、纯化，连接pGM-T载体，转化Escherichia coli TOP10感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，送北京奥科公司进行测序。根据3′端和5′端拼接序列设计2条特异引物为OMT6：5′-GAACGTAAAC