不同DNA提取的方法对肺癌血浆循环DNA抽提效果比较.docVIP

不同DNA提取的方法对肺癌血浆循环DNA抽提效果比较 　　摘要：目的：研究不同DNA抽提方法对肺癌血浆循环DNA的提取效果。方法：选取68例肺癌患者为研究对象，比较GenMagBio磁珠法、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法、苯酚-氯仿法对肺癌血浆循环DNA的提取效果。结果：几种方法中，磁珠法具有最高的提取效率和最低的CV值。结论：磁珠法对肺癌血浆循环DNA具有最好的抽提效果，适合于对小片段DNA的提取。 　　关键词：肺癌；循环DNA；抽提方法 　　中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2018）11-0274-02 　　循环DNA是存在于人和?游锾逡褐械陌?外DNA分子。研究表明，健康人群循环DNA含量极低（约5 μg/L左右）。当机体在炎症、自身免疫病和肿瘤等情况下，其在体液中的含量会大大增加，机制至今仍不明确。因为循环DNA与包括肿瘤在内的一些疾病的产生与发展密切相关，所以其对于肿瘤等疾病的早期诊断和疗效评价具有重要的临床意义。本文分别采用不同的DNA提取方法对肺癌患者的血浆循环DNA进行抽提，其结果报告如下。 　　一、资料与方法 　　1.一般资料：以2016年9月―2017年4月的68例肺癌患者为研究对象，其中男43例，女25例，平均年龄（58.2±4.6）岁。 　　2.方法：所有肺癌患者取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，以3000r/min，离心10min吸取上清血浆于冻存管中，-80℃保存备用。分别参照试剂盒及文献报道方法用血清游离DNA提取试剂盒（北京金麦格生物技术有限公司）、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（Sangon Biotech）、苯酚-氯仿法对肺癌血浆循环DNA进行提取。选取K-ras基因为目标基因，并设计扩增探针（Forward primer：5-ATTAAAAGGTACTGGTGGAG-3；Reverse primer：5-CTATTGTTGGATCATATTCG-3），对三种抽提方法所得循环DNA样本K-ras基因外显子2基因序列进行PCR扩增。扩增体系为：模板5 μL，扩增引物各2.5 μL ，Taq PCRm mastermix 10 μL。扩增条件为：95 ℃ 4 min；95 ℃ 40 S，43℃ 40 S，72℃ 40 S；40 循环，72 ℃ 3 min。以血清游离DNA提取试剂盒（磁珠法）提取循环DNA模板扩增条带为参照，用BIO-RAD凝胶成像分析系统测定其他两种方法对应扩增条带相对亮度比值，用以比较三种方法对循环DNA的抽提效果。选取同一血浆样本，三种方法分别重复提取5次，进行PCR扩增，比较不同方法扩增条带亮度差异情况，计算各方法的变异系数（CV）。 　　3.统计学方法：采用SPSS14.0进行，多个样本的比较采用x2检验。 　　二、结果 　　1.提取效率的比较。三种提取方法中，磁珠法对应泳道扩增条带亮度最大，SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法次之，苯酚-氯仿法最弱（见图1）。SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒方法和苯酚-氯仿法与磁珠法相比，其提取效率分别为67%%和49%（P0.01）。因此，三种方法中，磁珠法具有最高的提取效率，见表1。 　　2.三种方法抽提循环DNA重复性比较：通过比较各方法5次PCR扩增条带亮度差异值，磁珠方法的变异系数（CV）小于其他两种方法，说明磁珠法的重复性好，其他两种方法较差（P0.01），见表1。 　　三、讨论 　　外周血循环DNA来自于肿瘤细胞的坏死和脱落，研究表明，肺癌肿瘤患者外周血循环DNA含量显著高于正常人，并且在基因遗传性上与肿瘤原发组织具有高度的一致性[1，2]。提示循环DNA可为肺癌筛查、诊断及预后检测提供微创、方便的标本来源及检测对象。 　　Szpechcinski等[3]分别对16例健康成人和30例未经治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者循环DNA进行定量研究，结果显示，健康人循环DNA含量为0.9―7.0ng/mL，而NSCLC患者的范围为1.5―50ng/mL，提示非小细胞肺癌患者循环DNA含量大大增加，表明其作为一种肿瘤标志物具有重要意义。也有报道指出循环DNA的定量对于肺癌的分期、化疗监测等有着重要的意义，可作为肿瘤临床治疗的一种依据[4]。 　　近年来，把基因突变与肺癌的临床治疗相结合，开展EGFR、Kras等肿瘤标记基因个体化用药检测的研究得到快速发展[5，6]。王开云等[7]报道非小细胞肺癌患者血清循环DNA检测EGFR基因突变与肿瘤组织检测具有高度的一致性，对肺癌患者的诊断、筛查和治疗有着重要的意义。 　　由于血清中循环DNA含量极低，并且具有小片段的特征，因此，在提取时容易丢失，从而影响检测的灵敏度。可靠有效