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bFGF分析的方法学及其稳定性考察 　　【摘要】目的建立碱性成纤维生长因子的分析方法并考察碱性成纤维生长因子在不同温度、酸碱度及搅拌速度下的稳定性。方法利用酶联免疫吸附法对碱性成纤维生长因子的含量进行测定。结果标准曲线方程为：B/B0（%）=0.0814 c+93.404，相关系数r=0.9931，线性关系良好的直线方程；精密度RSD≤4%。药物在冷冻条件下保存最稳定；冷藏条件下保存，7 d后药物活性部分丧失。在4～15℃范围内、pH值在2.0～7.0之间以及搅拌速度为880r/min搅拌2 h的条件下，稳定性保持良好。结论ELISA分析方法快捷、准确、灵敏度高；碱性成纤维生长因子及其制剂宜冷冻保存。 　　【关键词】碱性成纤维生长因子；酶联免疫吸附法；生物活性 　　1仪器与试药 　　碱性成纤维生长因子冻干粉剂（暨南大学生物研究中心），碱性成纤维生长因子试剂盒（上海麦莎生物有限公司购买进口分装），pHS25型数显酸度计（上海天达仪器有限公司），TGL165型冷冻高速离心机（上海安亭科学仪器厂），CL3型恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司），BioTekModeL酶标分析仪（美国），AB135S电子天平（瑞士梅特勒托利多），101型电热鼓风干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司），BD239LT型低温冷柜（山东海尔集团） 　　2方法 　　2.1碱性成纤维细胞生长因子的理化性质[1，2]碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是一种非常不稳定的多肽，其冻干粉剂为类白色粉末，易溶于水，不溶于二氯甲烷、丙酮、氯仿等有机溶剂中，弱酸性及碱性环境、有机溶剂的存在等都会导致活性丧失。bFGF的等电点pI=9.6，偏碱性。bFGF有四种形式，以AUG为起始密码的相对分子质量为18000和以CUG 为起始密码的相对分子质量分别为22000、22500和24000，相对分子质量为18000的bFGF是其活性的主要形式。 　　2.2bFGF含量测定方法的建立 　　2.2.1ELISA含量测定方法与传统药物相比，多肽和蛋白质类药物具有种属特异性、免疫原性和非预期的多向性活性等特点，给这类药物的分析方法提出了特殊要求。优良方法的主要标志是：特异性高、灵敏度高、重现性好、回收率高、线性范围宽。现在常用的分析方法有：生物鉴定法、放射性同位素标记法和免疫学方法[3]。根据碱性成纤维生长因子的理化性质及生物学特性，本研究采用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）[4]测定药物含量。 　　ELISA法的操作步骤：①取出酶标板，依照次序对应加入100 μL的标准品和不同稀释浓度的待测样品于空白微孔中，分别标记样品编号，阴性对照孔加入100 μL的重蒸水，并分别做复孔。然后在标准孔和样品孔中加入50 μL的酶标记溶液混合15 s，于37℃孵育反应1 h，甩去酶标板中的样品液，用稀释后的专用洗涤液清洗5次，每次静置10～20 s，每孔加入底物显色剂A和B各50 μL，于37℃下避光孵育反应15 min后，再向每孔中加入50 μL终止液，终止反应。在酶标仪上于450nm波长处测定每孔的光密度（OD）值。 　　2.2.2标准曲线的制作及线性范围考察按照酶联免疫试剂盒操作说明，取出实验所需要的微孔板条，在室温下平衡30 min。依照次序分别精密吸取不同浓度的bFGF标准品溶液各100 μL，标准品浓度分别为0、50、100、250、500、1000pg/ml，按2.2.1中操作方法，于450nm处测定各浓度下药物的光密度值，记录结果见表1。以B/B0%值（B=标准品OD值，B0=标准品0浓度时的OD值）对bFGF浓度C进行直线回归，并绘制标准曲线，见图1。回归方程为： 　　2.2.3精密度考察精密吸取bFGF标准品溶液1000、250、50pg/ml，高中低三个浓度各100 μL，按照测定方法操作，加入酶检测板微孔中，于450nm处测定bFGF的光密度，重复测定3次，结果见表2。 　　2.2.4回收率实验精密吸取bFGF标准品溶液1000、250、50 pg/ml高中低三个浓度各100 μL，加入酶检测板微孔中，按照2.2.1中的测定方法操作，于450nm处测定bFGF的光密度，重复测定3次，将结果代入标准曲线计算含量及回收率，结果见表3。 　　3影响稳定性的因素考察[5] 　　3.1不同温度对bFGF稳定性的影响 　　3.1.1取bFGF原料药分装后的样品，配制成500、250、100 pg/ml高中低浓度的超纯水溶液各三份，将其中一组样品置于4～5℃冷藏条件下贮藏，分别在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d测定bFGF的光密度，代入标准曲线方程中计算bFGF的浓度，并进行比较