质粒的提取与鉴定DNA酶切.pptVIP

酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而定。使用中一般以1 μg DNA用2-3U酶进行酶切为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切酶的活力； 4. 操作条件：反应体系配置应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均在不同程度影响限制性内切酶的活性。 反应缓冲液： 1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.2~7.6之间； B. NaCl浓度： 低盐(10mM NaCl) 中盐(50mM NaCl) 高盐(100mM NaCl) 2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37℃，如EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是酶/DNA＝2~3，12小时即可充分酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL