PCRRLFP的方法检测IL6基因启动子区634CG多态性实验条件的研究.docVIP

PCRRLFP的方法检测IL6基因启动子区634CG多态性实验条件的研究 　　摘要：目的探讨PCR-RFLP技术判断IL-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件。方法对影响PCR的部分因素和影响RFLP方法的一些因素进行研究。结果PCR扩增IL-6基因启动子区的最适条件为：引物浓度为30umol/L；Taq酶量为5U； dNTP浓度为56μmol／L。最经济有效的酶切体系为20μl体系中加4μl产物用5U的酶消化9h。结论最佳的实验条件的探索是进行大批量实验研究的关键。 　　关键词：白细胞介素-6基因；多态性；聚合酶链反应-限制性片段长度多态性；试验条件糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)患者一种常见的严重的致盲眼病。DR也是DM常见且难治的并发症之一,在欧美各国四大致盲眼病中占第一或第二位, 在我国也是主要致盲病之一,约10%DM患者在起病后5～9年便可发生DR,15 年后约50 %的人发生DR,25 年后80 %～90 %的人发生DR[1]。DR的发病机制是环境和遗传因素共同作用的。长期的高血糖是最重要的原因，然而，DR的发生发展不同的个体差异很大，这也说明遗传可能起一定作用。近年来提出T2DM是一种亚临床炎症性疾病,作为炎症反应的核心细胞因子IL-6，张洁等[2]研究发现随着糖尿病视网膜病变程度的加重，泪液IL-6含量逐渐升高，提示泪液IL- 6水平与糖尿病视网膜病变的发生有关。体外培养视网膜Muller细胞显示：糖化蛋白终末产物可引起视网膜Muller细胞产生IL-6，并且存在剂量依赖关系，IL-6的增加与DR的发生密切相关[3]。我们就此多态性进行检测，旨在探讨L-6基因启动子区-634C/G多态性与中国广东地区汉族人DR是否存在关联。限制性内切酶是分子生物学中研究基因变异的一把手术刀，可以特异性切割所识别的碱基序列，利用这个特点，可以用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测基因片段中某一位点是否存在变异。L-6基因启动子区634位点对应限制性内切酶BsrBI（MbiI）的酶切位点，酶切后有三种情况：①酶切后PCR产物长度无变化，为CC基因型；②杂合型，电泳图谱出现三条带，即为CG基因型；③PCR产物被切开，为纯合型，即为GG基因型。尽管PCR和酶切是两种比较成熟的技术，但对于不同的模板和引物而言，所需的PCR反应条件是不同的。但如果实验条件把握不准确，可造成假阴性或假阳性结果，因此有必要对实验条件加以研究，以得出最适条件，进而才能得出准确可靠的结果。本文为确定PCR-RFLP方法检测L-6基因启动子区-634C/G多态性的最适实验条件，进而研究其与2型糖尿病视网膜病变的关系，对影响PCR反应以及内切酶酶切反应的实验因素进行了系统的优化研究。 　　1资料与方法 　　1．1实验材料主要仪器：BIO-RAD S1000基因扩增仪；Power Pac 3000型电泳仪和Gel Doc1000紫外图像分析系统和配套的分析软件（美国BIO-RAD公司）；5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；恒温和可控水浴箱（上海医疗器械厂）。 　　主要试剂：合成引物（北京市理化分析测试中心合成）：上游引物：5’-GAGACGCCTTGA AGTAACTG-3’，下游引物5’-AACCAAAGATGTTCTGAAC 　　TGA-3’。 5U/μl的TaqDNA聚合酶、100mmo1/L的dNTP和限制性内切酶BanII均购于宝生物（大连）有限公司；DNA分子量标记（Marker）购于天根生化科技（北京）有限公司；实验用水为去离子水。 　　1．2方法模板DNA的抽提：选用QIAamp DNA Mini kit试剂盒按说明书提取模板DNA，加入100 mL TE缓冲液，65℃水浴15~20min至DNA沉淀物质完全溶解，储存于4℃冰箱备用。 　　PCR扩增：首先建立PCR（聚合酶链反应）扩增目的DNA的实验条件。基本反应体系中模板1μL，10×缓冲液5μL，加去离子水至501μL条件不变，分别变化Taq酶量和dNTP、引物的浓度，按94℃预变性5min，后94℃45s，60℃45s,72℃1min进行30个循环, 最后72℃延伸5min。扩增产物的检测均用琼脂糖凝胶电泳法检测：制备2%的琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴乙锭），将扩增产物10μL与溴酚蓝加样缓冲液2μL混匀后和一份5μL MarKer同时加样，在100V电压条件下电泳30min，电泳结束后在Gel Doc1000紫外检测系统中观察扩增产物的电泳结果。 　　BsrBI限制性内切酶的酶解:IL-6基因启动子区-634位点变异纯合子GG可