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一种MicroRNA duplex的设计新技术的研究 　　摘　要：利用micmRNA数据库，获取3种微RNAmir-181a、mir-124和mir-1的成熟序列信息。基于siRNAdu-plex在形成RNA诱导的沉默复合物(RNA－induced silencing complex，RISC)过程中的不对称性的特点，初步设计了针对上述3种微RNA的microRNA duplex。采用生物学软件Oligo6．0分别评价其热动力学特性，并通过改变反义链3’端个别碱基序列使其满足热动力学的需求，从而确定最终的设计序列。结果显示，利用RISC形成过程的不对称性，结合生物学软件Oligo6．0的热动力学分析来设计mjRNA duplex，是一种简便可行、准确有效的方法。 　　关键词：微RNA；siRNA；生物信息学分析；热动力学性质 　　中图分类号：0522；Q751 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2006)02―0109-04 　　微RNA(microRNA，miRNA)是一类长约为22nt的非编码小分子单链RNA，在动物体内，它可以通过与对应的靶序列发生不完全互补配对，从而抑制特异性的mRNA的翻译，导致相应蛋白质合成减少。随着分子克隆技术和生物信息学的不断进步，科学工作者们已经从不同物种中发现了大量的miRNA，至今已经确定的人类miRNA有222个，约占人类全基因组的1％左右，但它们却调控了20％甚至更多的基因编码产物。 　　大量的研究表明，微RNA可能在人类发育调控、细胞增殖和死亡、造血过程等多种生物学过程中发挥重要的作用。然而，在动物体内，绝大多数的微RNA的具体功能仍然不清楚，这主要是由于miRNA靶基因识别存在一定的困难。在植物中，miRNA与靶序列发生近似完全互补，因而可以直接利用生物信息学的方法进行预测。然而，在动物体内应用生物信息学来预测靶点就比较困难了，因为大多数miRNA与其靶基因间仅有7～8个左右的碱基互补，因而往往会有大量潜在的候选靶位点。但无论是对miRNA的功能进行研究，还是对其靶基因进行验证，都需要人为地使所要研究的微RNA在体内发生瞬时或者持续高表达，进而进行针对性研究，这种方法类似于采用RNA干扰的方法进行靶基因的功能及相关研究。制备siRNA较为常用的方法包括，化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNase III类降解、构建siRNAs表达载体或者病毒载体、PCR制备的siR-NA表达框等。miRNA与siRNA尽管都属于小分子非编码RNA，但由于miRNA在形成过程、作用机制等方面的差异，决定了对miRNA研究的复杂性。本文重点要介绍的是一种基于siRNAduplex在形成RISC过程中的不对称性的特点，结合生物学软件Oligo 6．0进行热动力学计算的微RNA设计新技术，并针对mir－181a、mir－124、mir－1序列信息分别设计长为22nt左右的mir-NA duplex。 　　 　　1 方法 　　1．1 在miRNA数据库中查找对应序列信息 　　为了设计特定的miRNA，首先必须获取所要研究的miRNA的序列信息。目前国际上较为权威的数据库有microRNAregistry(http：//micror-na.sanger．ac．uk/)；而国内由清华大学生物信息学重点实验室建立的microRNAdb数据库，也提供了较为完整的miRNA的相关信息(http：//166．111．30．65/micrornadb/index．php)，到目前为止共收录了732个miRNA的序列信息。利用这两个数据库，可以获得microRNA的染色体定位、起止位点、前体及成熟序列信息(如长度、序列组成、二级结构自由能)等。 　　 　　1．2 基于功能siRNA的结构特点设计miRNA 　　RNA干扰当中非常关键的一步是形成RISC。最新研究表明，siRNAduplex的两条链在掺入形成RISC过程中的机率并非均等，这体现了其在功能上的不对称性。更确切地说，就是siRNA两条链的5＇末端碱基配对的绝对和相对稳定程度，将最终决定是其中的哪一条链参与RNAi。siRNA duplex的结构决定了仅有其中一条链参与形成RISC，而另外一条链则被破坏。不对称性也是miRNA的一大特点，在其形成过程中，类似siRNA duplex样的中间产物中的miRNA链将最终参与RISC的形成，从而使得miRNA在体内发生积聚。对于一个给定的靶基因mRNA来说，所设计的siRNAduplex应使其反义链更适宜进入RISC当中，因而反义链的5＇末端的碱基配对在热动力学上要比3＇末端更弱一些，这样才能获得形成RISC过程中的不对称性(见图1)。然而，为了获得最佳siRNA