人8-氧鸟嘌（8-oxoG）酶联免疫分析（ELISA）.docVIP

PAGE PAGE 1 人8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)水平。用纯化的人8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，再与HRP标记的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存 说明书 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃ 标准品：360 ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃ 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃ 酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃ 终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃ 浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃ 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃ 操作步骤 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为240 ng/L，160ng/L ，80 ng/L，40 ng/L，20 ng/L）。 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 注意事项： 试剂