均匀的设计法优化小半夏加茯苓汤效用组分配比实验的研究.docVIP

均匀的设计法优化小半夏加茯苓汤效用组分配比实验的研究 　　【摘 要】 目的：应用均匀设计方法优化小半夏加茯苓汤效用组分的配比。方法：建立H22荷瘤小鼠模型，将小鼠随机分为5组，按照均匀设计要求给予不同配比的半夏生物碱、茯苓多糖及姜辣素。连续给药10d后，次日处死。运用均匀设计方法，以瘤重为疗效指标，对数据进行处理。得到最优配比后，另增原方汤剂组、顺铂组、模型组和空白对照组各一组，将小鼠随机分为5组，连续给药10d后，次日处死。计算抑瘤率，检测对机体免疫功能的调节作用，对最优配比组方疗效进行验证。结果：由均匀设计方法得到瘤重回归方程（y=0556+006A+2091B-0271C，r=0079），其中当组方中茯苓多糖为0005mg、姜辣素为0195mg时瘤重最低。最优配比组方可反映原方汤剂的疗效，对移植瘤的生长发挥一定的抑制作用（P001）；同时与顺铂组相比，可提高小鼠免疫器官指数及血清中TNF-α、IL-2的浓度（P001）。结论：经过均匀设计法确定小半夏加茯苓汤的效用组分用量的优化配比，组方体现了一定的肿瘤抑制及免疫调节作用，便于对该方诱导肿瘤细胞凋亡的机制进行深入研究，有望用于肿瘤放化疗的辅助及预后治疗。 　　【关键词】 小半夏加茯苓汤；半夏生物碱；茯苓多糖；姜辣素；均匀设计 　　【中图分类号】R2855 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）05-0007-03 　　小半夏加茯苓汤是中医经典《金匮要略》中的止呕名方，临床配合西医学的化疗、放疗及药物的治疗，增强抗肿瘤的作用，减轻其他疗法的副作用，具有极大的临床实用推广价值。观察42例患者，发现小半夏加茯苓汤治疗化疗所致呕吐时在食欲减退、恶心、呕吐方面的有效率均高于甲氧氯普胺对照组，且与甲氧氯普胺有协同作用[1]。本课题组前期观察小半夏加茯苓颗粒所致家鸽呕吐次数，延长呕吐潜伏期，使每次发生呕吐的频率降低[2]。此外采用血清药理学的方法研究小半夏加茯苓颗粒抑制肝癌细胞的作用机制，发现含药血清对体外培养的肝癌SMMC-7721 细胞具有明显的抑制作用[3]。为了进一步明确小半夏加茯苓汤抗肿瘤效用组分及其配伍[4]，本研究选取半夏生物碱、姜辣素、茯苓多糖三种组分，应用均匀设计，以H22荷瘤小鼠为研究模型，选择出抑瘤效果最好的组方配比并对其疗效进行验证，为该方作用机制研究奠定基础。 　　1 实验材料 　　11 动物 昆明系小白鼠，SPF级，雌雄各半，10～12周龄，（20±2）g，购自长沙动物实验研究所，动物合格证号43006700001056。 　　12 细胞株 小鼠肝癌22（H22）是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一，属于腹水型细胞株，悬浮生长，细胞活性和形态优异，广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。本实验小鼠肝癌细胞（H22）购自中国医学科学院肿瘤研究所。 　　13 药物 小半夏加茯苓汤由半夏18g，生姜15g，茯苓9g组成，按照传统方法水煎（1g生药/ml），中药材半夏购于贵州赫章中药材GAP生产基地，茯苓购于贵阳济仁堂有限公司，生姜市售；顺铂购于贵阳中医学院第一附属医院（生理盐水配制为1mg/ml腹腔注射液）；半夏生物碱（每克含20克原生药，批号：RLQC130517）、姜辣素（每克含20克原生药，批号：RLQC130316）、茯苓多糖（纯度为60%以上，批号：RLQC130315-3）购于西安瑞林生物科技有限公司；用于动物灌胃给药的药液由蒸馏水配置。根据先前预实验及文献[5-7]报道的有效剂量，分别制定剂量范围（表1）。按均匀设计表U5（53）及其使用表进行安排，共得5种组分配比方案，将购买到的三种组分依据方案进行配制，得到实验用药物，其具体配伍见表1。 　　14 仪器与试剂 CO2培养箱，Napco公司产品；倒置光学显微镜，Nikon公司产品；超净台（型号：天津泰斯特CJ-1D）；低温高速离心机（型号：长沙湘；分析天平；酶标仪（型号：Thermal 1510）。 　　15 试剂 RPMI 1640培养基（购自美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（购自杭州四季青生物工程材料公司）；小鼠IL-2（批号：EM002）、TNF-α ELISA试剂盒（批号：EM008）购自上海依科赛生物制品有限公司。 　　2 实验方法 　　21 H22荷瘤小鼠模型制备 选用的H22肿瘤瘤株属小鼠的肝细胞瘤，无菌抽取腹部接种H22瘤株7d的种鼠腹水，用无菌生理盐水调细胞浓度为1×107/ml，每只小鼠采用右腋下接种方法进行接种相应瘤细胞液01ml。 　　22 分组及用药 　　221 均匀设计优化分组及给药 将昆明系小鼠在动物实验室饲养3d后，将100只小鼠按照均匀设计要求随机分为组方一、组方二、组方三、组方四、组方五5