海洋寡糖工程药物壳寡糖制备分离新工艺及其抗癌活性研究.docVIP

海洋寡糖工程药物——壳寡糖制备分离新工艺及其抗癌活性研究 垦煎生叠堂壁查生旦塑 文章绾号:1006—376X(2001)02-0006—03 海洋寡糖工程药物一 ChineJour【ofMieroecology,February200l 【述评】 壳寡糖制备分离新工艺及其抗癌活性研究 杜昱光,张铭俊,张虎,白雪芳 (中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023) 摘要:以梅洋甲壳多糖为原料,研究了酶法解钳备壳寡糖的方法.通=吐对专一性和非专一性障解用爵的筛选,确定以 壳聚糖酶或6036酶为降解酶;考察了底物浓度,酶量,温度,pH,溶解舟质等因素对障解反应的髟响;提出了反应与分离 相耦合制备壳寡塘的新构思{在此基础上进行了扩大试验,确毫L了谆=吐程实现工业化生产的可行性,对所生产壳寡塘的 抑瘤活性研究证明一定结构的壳寡塘具有很好的生钉括性,具有开发抗肿瘤药物前景. 美量词:壳寡糖制备壳聚塘酶;膜分离耦合;抗癌括性. 中图分类号:Q5柚文献标识码:A 壳寡糖是指2～10个氨基葡萄糖以9-1,4-糖苷键连接 而成的低聚糖,它通常是由甲壳翥(虾,蟹壳等)脱乙酰化的 产物壳聚糖的降解而获得.我国海岸线漫长,甲壳素资源十 分丰富,目前每年生产约2000～3000吨,因此,它的开发利 用具有十分重要的意义.壳寡糖具有多种优异的生理功能, 它能提高机体的免疫能力和抗癌能力J,改善肠道微生物 的区系分布,刺激有益茁的生长,还可作为植物功能i胃节 剂,刺激植物生长],增强植物对病虫害的防御能力]. 本工作是在国家科委九五攻关项目酵法生产低聚 糖及农韭部948引进项目的资助下完成,主要研究工作如 下: 1壳聚糖降解用一的筛选爱白僵苗的诱变选育考察壳聚 糖酶和脂肪酶,纤维索酶,菠萝蛋白酶,溶茁酶,6036酶对壳 聚糖的降解括性,表明这6种酶都是以内切方式切断糖苷键 的.其中壳聚糖酵和6036酶降解壳聚糖可得到较高聚合度 的寡糖.而且还原糖的液度和牯度下降的百分率较高(表 1).因而被确定为降解用酶. 对产壳聚糖酵的白僵茁进行了紫外诱变,获得了两株高 产酶的突变株,其活力比文献报道的同类茁高出s0倍,经6 代传代,表明有较好的稳定性. 表1各种一降解壳聚糖粘度下降百分率 处理酶粘度下舜百舟串() 脂肪酶 纤维素酶 壳聚糖酶 6036酶 菠萝蛋白酶 藩菌酶 704l 7632 94.65 93.32 90.36 2壳聚糖一降解特性的研究 21壳聚糖和6036酶降并反应的动力学研究表明两种 酵降解反应符舍米氏方程 VS/(+S) 计算出相应的动力学参数 6036酵一=0448g/min-LK=0.732g/L 壳寡糖酶一=0.3634g/min?LK=0679g/L 2.26036酶对壳聚糖的降解特性研完.观察底物的浓度 收稿日期:200~,0918 (囤2),醇用量,温度(囤3),pH(囤4)和溶解舟质(袁2)对降 解反应的影响. 表2溶解介质的选择 O5101520 裱物浓度s/t 圈1雇物浓度对酶活影聃 010203040506070 T(℃) 田2温度对一活的影聃 l23{5678 】 田3pH对一活的影聃 ¨0 i}E\:一E\L‰llz gL害蔓硅 ¨¨0呲¨. ∽E\E\日∞ p.g目螺溢 6中国傲生态学杂志2001年2月第13卷第1期ChineseIourr=slofM[~roecolo~v,February2O01,Vol13Nol 0.1 0o8 占006 no4 n02 0204060 瞳4壳聚糖降解产物的洗脱曲线 发现底骑浓度低于15g/L时,还原糖浓度随底骑浓度 增加而增加.高于15g/L时,还原糖浓度下降.当温度太低 时,溶液牯度太大,还原糖浓度较低.温度太高,酶活受到影 响.适宜的反应温度是40℃.在低pH条件下.酶的活性受到 抑制.而pH在60以上,因壳聚糖部分不溶,pH值选定在 4.2～5.6之间较为适宜.考察盐酸,柠檬酸和靖酸对壳聚糖 溶解的影响.低温下盐酸不能充分溶解壳聚糖,溶胀后牯跗 于器壁上.高温时壳聚糖会部分降解,柠糠酸反应速率较慢. 选定醋酸为溶解介质较为适宜此外还考察了酶的圊定化和 底物脱乙酰度对壳聚糖降解的影响. 2.3探讨白僵蓠对壳聚糖降解的特性结果发现,以白僵 茸培养液上清液降解壳聚糖,20h壳聚牯度下降90,降解 产物中除单糖,二糖外,还有39的三糖和6的五糖.如用 硫酸铵沉淀上清液得到了粗酶,12h底物基本降解完,阵解 3h的产物申,四糖,五糖占1O. 3降解产物的分析和分离提取 31分析测试方法建立时间飞行质谱分析测定壳寡糖聚 合度的方法及壳聚糖脱乙酰化度和产物中还原糖浓度的测 定方法. 3.2壳囊糖降解产转乙酰化产物的分离由于阵解产物中 有多种部分乙酰化的寡糖,很难用色谱法将其分离,将阵