LB液体培养基.pptx

生物工程大实验;前言 概念：生物工程（bioengineering）是运用生物学、化学和工程学等学科相结合的方法，利用生物体制造人类所需产品、改造环境的一门多学科交叉的应用技术。 ;应用：生物工程已经在食品、医药、轻工、农业、环境保护、能源等领域发挥了重要作用，已经产生了巨大的经济效益与社会效益。20世纪70年代开始，转基因技术、系统生物学、生物信息学、化学生物学、基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等学科或技术的建立与发展极大地推动了生物工程的快速发展。 ; 实验目的：通过本课程的教学使学生了解和掌握生物工程的基本原理、方法、技术和技能，通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生物工程探索的兴趣和爱好。;目标：通过本课程的教学使学生了解和掌握生物工程的基本原理、方法、技术和技能，通过学生的独立实验设计和实践，训练学生分析问题和解决问题的能力及实际动手能力，同时培养学生的创新思维以及对生物工程探索的兴趣和爱好。 ;实验准备： 1、LB培养基： 液体（每人）：1个三角瓶（50ML），试管4个（5mL），{250-300mL/组} 抗性平板每人1个（每组50mL） LB液体培养基：在95mL ddH2O中加入胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl 1g，用1M的NaOH调节pH=7.0，定容至100mL，分装入试管中，5mL/管，121℃，20min高压灭菌。 LB固体培养基：100 mL LB培养基加入1.5 g琼脂粉，高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置于55 ℃的水浴中，待培养基温度降到55 ℃时（手可触摸）加入AMP（终浓度100 mg/L），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。一般10 mL倒1个培养皿。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15min。封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。 ;实验准备： 2、蓝、黄、白枪头，每组各一盒；Ep管装满50mL烧杯；包好灭菌； 3、配制蛋白质电泳试剂：每组1块胶，可3-4组共用一套原液； 10%SDS（十二烷基磺酸钠） 0.1%溴酚兰溶液 聚丙烯酰胺溶液(30%T,3.3C%): 29.2g丙烯酰胺,0.8g双丙烯酰胺,定容100mL,过滤，避光保存。 4×分离胶缓冲液： 18.17 g Tris, 10% SDS溶液4mL， pH8.8，定容100mL。 4×浓缩缓冲液： 6.07 g Tris, 10% SDS溶液4mL，pH至6.8，定容100mL。 2×样品缓冲液：0.2422 g Tris，1.6 g SDS，4mL甘油，2 mL巯基乙醇，1.0 mL 0.1%溴酚兰和 13 mL三蒸水，PH 6.8。 10%AP：新鲜配制，0.1 g过硫酸铵+1 mL双蒸水。 1%TEMED； 电极缓冲液：将6g Tris，28.8克甘氨酸和1克SDS加水溶解后，定容到1000mL，pH应为8.3。 染色液：0.5g考马斯亮蓝R-250溶于90mL甲醇，90mL双蒸水，20mL冰醋酸。 标准脱色液：75 mL冰乙酸，875 mL重蒸水与50 mL甲醇混匀。 PMFS溶液：10mg PMFS溶于1 mL异丙醇（或无水乙醇） PBS（pH7.4-7.6）：8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，溶于800mL蒸馏水 中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。 注意：试剂配制一定要准确，否则影响后续试验结果。;一、表达载体的转化与筛选 ;蓝白斑筛选 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，失去正常N端一个146个氨基酸短肽，不具有生物活性。 蓝白斑筛选载体具有lacz’基因。 操作中，添加IPTG，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。 ;实验流程： 1、蓝白斑筛选 (1) 把DH5a感受态细胞置于冰中解冻，待感受态细胞即将完全融化时着手下一步。 (2) 把50-100 μL的感受态细胞移至灭菌处理的试管内。 (3) 加入用于转化的DNA或反应产物（10 ng以下）。 (4) 冰中放置30min。 (5) 42℃ 放置30～60s。 (6) 冰中放置2～3min。 (7) 加入37℃预温好的LB液体培养基500ul（不含抗生素），。 (8) 37℃振荡培养1 h（160～225 rpm）。 (9) 取适量（约200ul）震荡培养液均匀地涂布在蓝白斑筛选平板内。 (10) 37℃过夜培养。 (11) 枪头挑取白色菌落，放入LB液体培养基（氨苄终