蚕蛹蛋白ACE抑制肽的制备及其理化性质研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要 摘 要 蚕蛹是蚕茧缫丝的副产物，由于色泽与口感较差，因而限制了它在食品和药品工 业中的应用。本文旨在利用酶法制备蚕蛹蛋白 ACE（血管紧张素转化酶）抑制肽，以 扩大其生产应用范围。通过 SDS（聚丙烯酰胺凝胶电泳）、氨基酸组成分析、 DSC（差示扫描量热仪分析）等方法研究了蚕蛹蛋白及其分离蛋白组分的理化性质； 以酶解产物的 ACE 抑制活性为评价指标，采用响应曲面法对酶法制备蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽的工艺进行了优化；并采用超滤、DEAE-52 和 Sephadex G -50 柱层析等方法对 蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽进行了分离纯化，初步探讨了蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽对 ACE 的作 用机制。 干蚕蛹中，粗蛋白的含量为 57.61 %，其中，水溶性蛋白和碱溶性蛋白是蚕蛹主要 的蛋白组分。蚕蛹水溶性蛋白和碱溶性蛋白的氨基酸种类齐全，且必需氨基酸占总氨 基酸的质量分数分别为 41.24 %和 39.16 %，明显高于 WHO 推荐的氨基酸组成模式 （36 %）；蚕蛹水溶性蛋白有 2 次热变性过程，起始变性温度分别为 45.98 ℃和 88.87 ℃，蚕蛹碱溶性蛋白有 1 次热变性过程，其变性起始温度为 180.37 ℃。蚕蛹水溶性蛋 白和碱溶性蛋白的 Alcalase 酶解产物均具有较强的 ACE 抑制活性，IC50（半抑制浓度） 分别为 0.121 和 0.113 mg/mL。 以酶解产物对ACE的抑制率为评价指标，从Alcalase、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶 中筛选出Alcalase做为蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的水解用酶，并采用响应面试验设计方 法对酶法制备蚕蛹蛋白ACE抑制肽的工艺进行优化。确定最优工艺参数为：pH 9.0、 酶解温度50.8 ℃、加酶量3500 U/g；在此条件下，得到的蚕蛹蛋白酶解产物对ACE的IC50 值为0.102 mg/mL。 蚕蛹蛋白酶解产物经超滤分离后，ACE 抑制活性最强的是 MW（分子量）5 kDa 组分，其次依次为 5～10 kDa 组分和 MW10 kDa 组分。利用 Lineweaver-Burk 方程发 现 MW5 kDa 组分对 ACE 呈现一种竞争性抑制关系；此外，紫外光谱分析表明 MW5 kDa 组分能够改变 ACE 的结构。蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽的性能试验表明，蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽具有良好的酸、热稳定性和抗肠道酶消化能力。 蚕蛹蛋白 ACE 抑制肽经 DEAE-52 柱层析和 Sephadex G -50 柱层析纯化后，其活 性得到极大的提高，它的 IC50 值为 0.072 mg/mL，分子量分布为 226.34～983.61 Da， 由 2～8 肽组成，其中，分子量为 474.63 Da 的肽链是主要的活性成分。 关键词 蚕蛹蛋白；酶解；ACE 抑制活性；分离纯化；结构分析 I Abstract Abstract Silkworm pupae is a by-product of silk reeling industry. The protein source has poor utility for the applications of food and medicine industry due to its bad color and taste. The objective of this study was to prepare angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from silkworm pupae protein by enzymatic hydrolysis. The physicochemical properties of silkworm pupae protein and its fractions were investigated by the methods of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS), amino acid analysis and differential scanning calorimetry analysis (DSC). According to ACE-inhibitory activity of hydrolysates, the enzymatic hydrolysis technology of ACE-inhibitory peptides from silkworm pupae protein was also optimized by response surface methodology. ACE-inhibit