对虾样品常温保存液的筛选及核酸快速采集工具的制备-渔业专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校 保留并 向国 家有关 部门或 机 构送交论 文的复 印件 和电 子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 □ ，在 年解密后适用本版权书。 不保密 □ 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 对虾样品常温保存液的筛选及核酸快速采集工具的制备 The selection of preservation solution for shrimp at normal tempreature and preparation of a simple tool for nucieic acid extraction 学位论文完成时间： _ 指导教师签字：_ 答辩委员会签字： _ 上海 上海海洋大学硕士学位论文 对虾样品常温保存液的筛选及核酸快速采集工具的制备 摘 要 随着分子生物学技术在水产动物疾病诊断中应用的逐渐深入，动 物组织中核酸的有效保存成为后续分子学研究的关键。一种安全、方 便的水产动物样品保存液，将为水产动物样品采集及后续的分子研究 提供方便。 本论文以凡纳滨对虾为研究对象，以铵盐、乙醇为基础成份，通 过不同的组合筛选一种常温下对凡纳滨对虾核酸有较好保存效果的保 存液配方。将乙酸铵、甲酸铵、硫酸铵分别在 0%、30%乙醇、50%乙 醇和 70%乙醇中溶解到饱和状态，添加 EDTA 和柠檬酸钠后调节 pH(5.2、6.0、7.0)得到 36 种保存液。对凡纳滨对虾 RNA 溶液的保存实 验结果显示，28℃下，70%乙醇为溶剂的饱和乙酸铵溶液和 50%、70% 乙醇为溶剂的饱和硫酸铵溶液保存 3d 回收的 RNA 28S 和 18S 条带完 整、界限清晰。 在以上结果的基础上以不同浓度乙醇为溶剂，配制不同 pH 的硫酸 铵和乙酸铵饱和溶液，测试其对凡纳滨对虾组织的渗透效应和对 RNA 在常温条件下的保护作用。结果表明，乙酸铵比硫酸铵在乙醇中的溶 解度高的多，而且其铵离子的摩尔浓度在 0—80%乙醇溶剂中比较稳 1 定。乙酸铵比硫酸铵能更快渗透到整体的对虾组织中，并达到更高的 浓度。硫酸铵在 70%乙醇中的饱和溶液和乙酸铵在 50%乙醇中的饱和 溶液（pH6.0）保存的 RNA 条带完整清晰，保存效果较好，荧光定量 PCR 结果显示保存 7d 后硫酸铵在 70%乙醇中的饱和溶液和乙酸铵在 50%乙醇中的饱和溶液（pH6.0）中提取 RNA 的拷贝数下降均不超 5 倍，RNA 半衰期都在 2.5d 以上。但综合考虑到硫酸铵在 70%以上乙醇 中的低溶解度和高浓度乙醇存在的安全隐患，我们最终推荐 50%乙醇 溶液中的饱和乙酸铵溶液（pH6.0）作为样品采集及常温保存的保存液。 该结果为野外样品采集及常温运输提供一种有效方法。 为探索一种可应用于现场快速采集核酸的简易工具，本论文以纤 维素材料的木、竹牙签为基质，并分别经过氨基化处理和季氨基化处 理，以 FTA 膜片为对照，吸取核酸溶液后分别用去离子水、TE buffer(pH 8.0) 、1? PCR buffer 进行洗脱回收。结果显示，70℃预热的 TE buffer 洗脱效果最好。对不同浓度核酸溶液和组织匀浆液的吸附试验结果显 示不经化学改性的的竹牙签的回收效果及灵敏度与价格昂贵的 FTA 膜 片差不多或者更好。最终推荐经过一定预处理的竹质牙签为核酸快速 提取工具，以预热的 TE buffer(pH8.0)为洗脱 buffer 应用到现场核酸快 速采集中。 关键词 常温，保存，DNA，RNA，采集工具 2 The selection of preservation solution for shrimp at normal tempreature and and preparation of a simple tool for nucieic acid extraction Abstract The applicaton of molecular biology in the diagnosis of aq