常见的检疫性植物病毒高通量检测方法的建立和比较-食品科学与工程专业论文.docxVIP

上海 上海海洋大学硕士学位论文 近几年，各口岸进境农作物不断增加，传统意义上的PCR检测灵 敏度较高，通量低。本研究以Agdia公司购买的ToRSV和TRSV毒源， ArMV侵染的百合种球为实验材料，根据ArMV、ToRSV和TRSV 的 CP 基因设计合成多对引物，进行筛选，优化反应条件，进行特异性 和灵敏度验证。在此基础上进行多重PCR，优化多重PCR 反应条件， 分别扩增出ArMV 438bp，TRSV 300bp，ToRSV 131bp 的特异性片段， 建立了同时检测百合种球中ArMV、TRSV和ToRSV 的多重RT-PCR 体系和SYBR-Green PCR体系，大大缩短了检测时间，简化了操作步 骤，具有较强的应用价值，适合进境植物的快速检测，在出入境检验 检疫中具有广泛的应用前景。 本研究还通过聚苯乙烯荧光微球与病毒多抗交联，采用标记有生 物素的另一配对单抗以及藻红蛋白标记的亲和素组成相应的荧光报 告系统，用液相芯片仪Luminex200 检测待检样本荧光强度，建立了 TSWV、INSV 及IYSV 液相芯片高通量检测方法。实验结果表明能 同时检测出这几种病毒而不发生交叉反应。将液相芯片与DAS-ELISA 的检测灵敏度进行比较，结果表明液相芯片检测TSWV，INSV和IYSV 的灵敏度高于DAS-ELISA 1-2个稀释度。以IYSV血清为例，在2012 年9月20日到2012年10月26日间进行重复性检测，共计5次，计算变异 系数，其值均小于20%，说明该方法重复性较高。本实验建立的同时 检测三种病毒的液相芯片方法为进一步建立其他检疫性病毒同步检 测提供了技术支持，使液相芯片技术在病毒检测方面有着更广阔的应 用前景。 本实验建立的同时检测三种病毒的液相芯片方法为进一步建立 其他检疫性病毒同步检测提供了技术支持，使液相芯片技术在病毒检 测方面有着更广阔的应用前景。 关键字： 凤仙花坏死斑病毒，鸢尾黄斑病毒，烟草环斑病毒，多重 RT-PCR，液相芯片 Establishment and comparision of high-throughput assay for several plant quarantine viruses ABSTRACT Plant virus can cause huge losses to crops and economic crops yield. Nepovirus include Arabis mosaci virus (ArMV ） ,Tobacco ringspot virus(TRSV ） and Tomator ingspot virus(ToRSV). ArMV and TRSV are quarantine virus of second level,and ToRSV is quarantine virus of frist level.Tospovirus is the only one of the bunyaviridae infecting plant,including Tomato spotted wilt virus(TSWV),Impatiens necrotic spot virus(INSV),and iris yellow spot virus (IYSV). Plant viruses unevenly distribution,low content, and the sampling limitations will affect the detection sensitivity.In the study,lily bulbs imported adding ArMV were chosen as experimental materials for two differen pre-treatment methods—immunomagnetic beads adsorption and PEG precipitation.The result shows that pretreatment can greatly enriched plant virus ,improving the detection rate. In this experiment,PEG precipitation effect is better than that of immunomagnetic beads adsorption. This study uses ily bulb infected with ArMV , ToRSV and TRSV purchased from the Agdia company as the experime