草鱼呼肠孤病毒拮抗宿主细胞RNA干扰信号通路的机制研究-临床兽医学专业论文.docxVIP

上海海洋大学硕士论文 上海海洋大学硕士论文 万方数据 万方数据 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 答辩地点 答辩日期 摘 要 草鱼呼肠孤病毒隶属于水生呼肠孤病毒属，是引起草鱼出血病的主要病原。 该病毒基因组由 11 条双链 RNA 组成，共编码 7 个结构蛋白和 5 个非结构蛋白。 GCRV 导致宿主细胞融合、凋亡、应急颗粒产生等病理变化。GCRV 的双链 RNA 能够在病毒正常复制周期避免结合 Dicer 并逃逸宿主 RNAi 抗病毒作用通路。 本文利用 RACE 技术、Real-time PCR、细胞转染等方法对以下三个方面进行 研究： 1. 草鱼 Dicer 基因的克隆与表达 在 RNAi 介导的沉默机制中, Dicer 发挥着重要的作用。本研究通过同源克隆方 法和 RACE 技术获得草鱼 Dicer cDNA 序列, 其开放阅读框为 5646bp，编码 1881 个氨基酸。草鱼 Dicer 含有其他生物 Dicer 的所有结构域。在草鱼脑、鳃、头肾、 肝脏、脾脏、心脏、肌肉、和肠 8 个不同组织中, Dicer 基因均有分布。GCRV 感染 CIK 细胞条件下，Dicer 表达在 24h 时上调，与对照组显著性差异。同样在 Poly(I:C) 刺激 CIK 细胞条件下，Dicer 表达在 2h 时上调，与对照组显著性差异。不同组织 的时序表达研究结果显示,在肝脏中, 草鱼 Dicer 在病毒感染 12h 时表达量开始上 调, 且与对照组有显著性差异,72h 时恢复到正常水平;而在脾脏组织的表达模式和 肝脏的表达模式相似。同时，进行草鱼 Dicer 的原核表达，蛋白纯化和多克隆抗体 的制备。 2. 鉴定拮抗宿主 RNAi 的病毒蛋白 将病毒的 12 个基因构建到 pEGFP-N1 真核表达载体，并表达 EGFP 融合蛋白。 将重组质粒和 GFP (荧光蛋白基因)特异性的 shRNA 共转染到 CIK 细胞中。转染后, 用荧光显微镜观察 GFP 蛋白的荧光强度，并实时定量 PCR(qRT-PCR)检测 GFP mRNA 的表达量, 确定 NS31 蛋白是病毒编码抑制 RNAi 的蛋白。 本研究成功克隆草鱼 Dicer 基因、并对 GCRV 和 Poly(I:C)产生免疫应答，这 为草鱼的抗病免疫应答机理提供了新思路。初步鉴定 NS31 是抑制宿主 RNAi 的病 毒蛋白，这加深了对病毒复制策略和感染机制的认识。 关键词：草鱼呼肠孤病毒、RNA 干扰、发卡 RNA、基因克隆、Dicer 基因 ABSTRACT Grass carp reovirus (GCRV), the type strain of Aquareovirus C, is the most important pathogen of grass carp hemorrhagic disease. The viral genome is composed of 11 segments of double stranded (ds) RNA, and encodes 7 structural proteins and 5 non-structural proteins. The interactions between GCRV and its host cells consist of cell membrane permability, apoptosis and stress granule formation. Genomic dsRNA fragments of GCRV can survival from Dicer-initiated RNA interference (RNAi) pathway in host cells. RACE technology, Real-time PCR, Transfection were employed in the study. The three results were as follows: The molecular cloning and expression of CiDicer in grass carp Dicer protein plays a key role in RNA interference (RNAi) pathway. In this study， the Dicer gene (designated as CiDicer) was cloned and identified from grass carp Ctenopharyngodon idella. The complementary DNA (cDNA)