对谷氨酸损伤的乳鼠脑片神经细胞用不同浓度神经生长因子后处理的作用研究-麻醉学(ICU)专业论文.docxVIP

贵阳医学院 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 PAGE PAGE 10 族，在细胞凋亡的程序上起到举足轻重的作用，而caspase-3属于这一家族成员 中的Nedd-2亚家族中的一员，主要的作用是调节细胞凋亡[8]。研究表明半胱氨酸 蛋白酶家族中的caspase发生反应的最终结果是细胞的凋亡，神经细胞凋亡时与 caspase-3表达时所显像的与相一致[9]，caspase-3被证实处于该级联反应的下 游，caspases-3起着最后枢纽的作用，细胞凋亡的最后关键环节是caspase-3。 正常人脑神经元中几乎无caspase-3蛋白表达，而在脑缺血时神经元中caspase-3 蛋白表达明显升高，并且无法逆转这是已经被研究[10]证实的。 神经营养因子家族中成员中的神经生长因子 (nervegrowthfactor NGF) 是 在神经系统活动中的具有活性蛋白类物质,NGF一方面能够促进神经元的生存，为 受损伤的神经的修复提供营养，加速修复[11]；另一方面还能增加自由基清除剂的 活力，对抗自由基； NGF还能够促进神经细胞成熟的作用，抑制细胞凋亡[12],而 且还对损伤的神经细胞起到保护和修复以及再生作用[13]。在神经系统遭到各种损 害（包括物理的如切割伤，化学的如有毒药物等）时，神经生长因子能够保护神 经细胞，减轻伤害程度，并且在临床上缓解因损伤带来的神经症状。 本次课题研究中通过建立谷氨酸损伤模仿脑缺血/再灌注损伤模型，用不同 浓度NGF进行后处理，考查NGF疗效并探讨其可能对神经细胞产生保护作用的机 制，为神经生长因子的临床应用以及相关疾病的治疗提供更丰富的理论基础。 材料与方法 1 材料 1.1 实验动物： 出生 7 天 SD 乳鼠（平均体重 17±1.2g），雌雄不限,由贵阳医学院实验动物 中心提供。所有的操作和实验流程均遵守 “贵州省实验动物管理”。 1.2 主要仪器设备： CO2 恒温培养箱（LT-CIX） （立德泰勤）上海科学仪 器股份有限公司 振动切片机（ZQP-86 型） 上海之信有限公司 手提式压力蒸汽灭菌器（YSQ-ST46-281A） 上海博讯实业有限公司 电热恒温水浴箱（OR-HAV-2） 北京医疗器械有限公司 高级数码显微摄像系统（DFC280-x） 德国莱卡有限公司 数显鼓风干燥箱（GZX-9030 MBE 型） 上海博讯实业有限公司医 疗设备厂 摇床 BTY 型， 上海博通医疗设备公司 0.5-20μl 微量可调移液器 芬兰 Labsystems 医疗仪器 有限公司 100-1000μl 微量可调移液器 美国 Gilson 医疗仪器有 限公司 倒置相差显微镜（XSJ-D） 德国莱卡光学仪器有限公司 电热恒温水浴箱（600 型） 北京市永光明医疗仪器厂 台式离心机(TDL-40B) 上海安亭科学仪器厂 透射电镜（H7650） 日本日立医疗公司 徕卡 LAS 显微镜 德国徕卡光学仪器有限公司 680 型全自动酶标仪 美国康乐仪器公司 托盘扭力天平（TN-100B 型） 上海上平仪器有限公司 6 孔/96 孔培养板 美国康贝有限公司 超纯水系统（PL5123） 美国颇尔水处理有限公司 1.3 主要试剂 DMEM/F12 培养基 美国英杰公司 优质胎牛血清 天津灏洋生物工程材料有限公司 链霉素 深圳华药南方制药股份公司 青霉素 华北制药有限公司 Millicell 立体培养皿 美国密理博 Millipore 有限公司 谷氨酸 北京索莱宝科技有限公司 4%多聚甲醛 武汉博士德生物工程有限公司 TTC 美国 Sigma 公司 神经生长因子 北京中杉金桥生物技术有限公司 LDH 测试盒 凯基生物科技发展有限公司 Caspase-3 兔抗 北京中杉金桥生物技术有限公司 DAB 试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司 1.4 试剂配制 1.4.1 完全培养基：DMEM/F-12 溶液 80ml,加经加热灭活的胎牛血清 20ml, 再加双抗溶液 1ml，调节 pH 值至 7.4，溶液渗透压 290mOsm/L，-20.C 储存备用。 1.4.2 1mmol/L 谷氨酸溶液：称取谷氨酸 0.147g，加入 DMEM/F-12 不完全培 养基至 50ml,配制浓度为 20mmol/L 的谷氨酸溶液。再取 5ml 20mmol/L 谷氨酸溶 液加到 95ml 不完全培养基中即为 1mmol/L 谷氨酸溶液（不含血清），-20℃储存 备用。 1.4.3 0.01mmol/L 磷酸盐缓冲盐（PBS）：NaCl 136.8mmol/L,KCl 2.7mmol/L , KH2PO4 1.4mmol/L ,Na2HPO4 7.9mmol/L,三蒸水溶解并定容至 1000ml，调节 PH 值为 7.40，用 0