二代测序技术在医学领域中的应用-医学课件.pptVIP

大多数的SNP都是无用的 大多数的SNP属于沉默突变。 非编码区的错义突变也不会导致蛋白质发生改变。 但也有例外 诊断实例： Dr. James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。 Dr. James Gern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。 钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PCR方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。 在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。 2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。 Kuroda, M., Katano, H., Nakajima, N., Tobiume, M., Ainai, A., Sekizuka, T., … Sata, T. (2010).. PloS One, 5(4), e10256. doi:10.1371/journal.pone.0010256 Nimblegen (Roche) SureSelect(Agilent) RNA Oligo Trusight (Illumina) 全外显子测序（WES） 癌症相关（人） 遗传性疾病（人） 其它非传染性疾病（人） 主要用于寻找罕见突变，遗传性突变及癌症相关的体细胞突变 可以做SNP，InDel分析，但由于捕获区域较短，一般不用于CNV，SV分析。 WES应用领域 成本低（一般50-150X，也仅需要8-15G数据） 降低分析背景，容易发现稀有突变。 大约能测到50-80bp的片段缺失，由于外显子捕获芯片片段较短，很难判断是由捕获脱靶导致还是由缺失导致。 同样因为捕获芯片片段较短，一般不做CNV，SV分析。 WES特点 WES方案流程 包括mRNA-Seq，lncRNA-Seq，sRNA-Seq等。 可以高通量分析转录本信息，发现未知的转录本和基因注释。 寻找个体间，同一个体不同时期等感兴趣基因表达丰度变化。 转录组测序(RNA-Seq) mRNA-Seq方案 有关lncRNA的一些知识： 长度大于200bp 无法编码蛋白 有内含子区和外显子区 非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。 所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对lncRNA的分析，并且发现了许多新的lncRNA。 lncRNA-Seq sRNA-Seq RNA-seq的优势 不局限于已知的基因组序列信息，适用于未知基因组序列的物种的高通量转录组研究 相对于芯片技术，背景信号值低，没有检测上限，对于基因表达谱有非常宽的检测范围。在有内参的情况下，在定量方面显示出了较高的准确度和可重复性。 不需要克隆的步骤，操作简单，需要的样本量少，可在单细胞的水平上进行表达谱分析 通量高，成本比Tilling array或者大规模的EST测序要低。 RNA-seq的挑战 文库构建过程中大片段的RNA必须经过片段化处理，会引入一定的偏倚。 PCR会造成表达量的变化。 海量短序列数据的比对或拼接情况复杂，对重复序列和多匹配序列的精确定位存在明显问题。 高等真核生物可变剪接和反式剪接的鉴定仍有相当的误差。 测序深度的确定因物种、器官、组织、时期而变，很难有统一公式直接计算。 石蜡包埋样本解决方案 FFPE样本(石蜡包埋切片组织) 石蜡包埋技术（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE）是现今临床上最常见的保存DNA方法，全球医院的珍贵临床样本中超过80%都使用该技术保存，但由于该技术DNA经过福尔马林浸泡，使DNA分子发生交联和酶修饰，导致DNA存在不同幅度的降解。 样本量巨大，80%以上的临床样本都使用石蜡包埋保存 很多珍贵的临床样本已经做过组织学，病理学研究，很容易完成相关实验验证 为何要使用FFPE样本 难于抽提，福尔马林处理后的