2016年硕士实验课.ppt

分子生物学实验基础 基本实验 主要内容包括 核酸分离提取和定性定量 质粒和RNA提取 电泳 基因扩增和分析 PCR技术 转染和报告系统 细胞转染 荧光素酶报告 二、定量定性分析 紫外吸收法 特征 变性与复性中的紫外吸收 DNA与RNA特点 荧光染料法 通常结合电泳方法 核酸电泳定性定量 原理：DNA、RNA本身并不产生荧光，但在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意，此法的特点：解决了紫外法无法判断变性和降解干扰数据的问题（样本保存）。尤其是结合核酸电泳，实际判断意义更为重要！ PCR技术 分子生物学技术 基因重组 质粒载体筛选方法 插入失活 α－互补：IPTG,X-GAL 直接筛选：抗生素 表达筛选（抗体筛选） Probe筛选 质粒载体缺点 ＣaCl2转化效率低 克隆片段小于１０kb 大量筛选时需要细胞裂解 4. DNA重组体的鉴定 外源DNA片断是否插入载体构成重组DNA分子，而插入片断大小，是否突变及插入位置，顺序及方向则关系到构建载体是否扩增，我们所需要的基因或表达，表达相应的产品，所以需要进一步鉴定DNA重组体 （1） 酶切鉴定是必需的，基于下述: A. 限制性图谱个体特异性，不同的载体或DNA分子物理图谱不同，酶切后片段大小不一样，电泳图谱不一样。 B. 同一载体连接不同的DNA片断，不同的载体连接同一片段(片段上也有位点）酶切图谱是不同的 。 C. 插入法(单酶单切点)或替代法(双酶双位点)酶切，一般来说用3种限制酶切： ①可鉴定载体及 ②插入片段的大小,方向,切后并电泳分析,以确定是否得到预期的rDNA。 （2）若构建DNA重组体是为了克隆某个基因，可进行在序列测定。 （3）若构建表达载体，可进行表达产物鉴定。 实验十二 DNA的连接与转化  1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 一．实验目的及背景 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。 1、ＤＮＡ分子的体外连接 ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。 连接反应中值得注意的几个问题： 1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。 Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 Ｔ４连接酶作用分三步： １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来. 2.连接反应的温度 ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。 3. DNA的平未端和粘性末端 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的， 4.碱性磷酸酶处理质粒载体 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。见下图。 5.连接反应的检测 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 我们下面的实验从粘性末端为例操作。 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 一．实验目的及背景 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。 １．抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基