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酶联免疫分析检测人白三烯B4 实验目的：用ELISA测定人血清样本中白三烯B4(LTB4)的含量，掌握ELISA的工作原理、适用对象和操作方法。 实验原理：用人LTB4抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中加入LTB4，再与HRP标记的LTB4抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物(双抗体夹心法)，洗涤后加底物TMB。 TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的LTB4呈正相关。 用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人LTB4浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成 48孔配置 96孔配置 保存 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1个 1个 酶标包被板 1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：54ng/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存 酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存 终止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存 浓缩洗涤液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。 4. 细胞培养上清：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分），收集上清。 5.细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml?左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。 6. 组织标本：切割标本后，称取重量。1g组织加入9ml?PBS（浓度为0.1M，pH为7.4的）,充分匀浆，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。 1.取出试剂盒，室温放置30分钟。 2.分组：取出96孔板，根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数，把剩余的板条继续冷藏处理。分别设标准品组（5个浓度）、空白孔、待测样品组。 3.标准品的稀释：准备小管5?只，依次编号，先在各小管中加入标准品稀释液100ul，然后取原浓度标准品100ul?加入1号管中，混匀;再从该试管中取100ul?加入2号管中，充分混匀；依次重复到5号管. 4.样品的稀释：包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍） 注：为减少实验误差，保证准确性，建议设置复孔。 操作步骤 5.加样：依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中；空白对照孔加入50ul的蒸馏水；在酶标。 *将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 6.温育：用封板膜封板后置37℃温育30?分钟。 7.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30?秒弃去，如此重复5?次，拍干。 8.加酶标溶液：标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液（空白对照孔除外）。 操作步骤 8.温育：酶标板用封板纸密封后，放入湿盒内于37℃恒温孵育30min。 9.洗板：用稀释后的洗涤液注满每孔，静置15-30s，充分清洗酶标板5次，用吸水纸彻底拍干。 10.显色：各孔加入显色剂A液50ul后，再加入显色剂B液50ul。 11.终止：25-37℃下避光反应10-15分钟，加入50ul终止液。 12.读板：在450nm波长读取各孔的OD值。 操作步骤 注意事项 *试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 * 浓缩洗液可能会有结晶析出，在水浴中加温助溶。 * 加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内。 * 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 计算 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。然后根据样品的OD 值计算出样品的浓度，再乘以稀释倍数即为样品的实际浓度。 *封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 *