生物化学--蛋白质的分离纯化与鉴定教学幻灯片.pptVIP

第六节;二、 蛋白质分子大小与形状;蛋白质的稀溶液： π：渗透压（大气压） R：气体常数 T：绝对温度 c：溶质浓度（g/L） 测定几个不同浓度的渗透压，用π/c对c作图外推到蛋白质浓度为0，得到截距，代入公式求得分子量。 要求在等电点附近测定，并增高无机盐浓度 装置简单，准确，但不能判别样品是否纯净 ;二、 蛋白质分子大小与形状;二、 蛋白质分子大小与形状;1.沉降速度法 把蛋白质样品溶液放在离心机内，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质分子的沉降速度。 在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，观察到界面的移动。 斯维得贝格方程 M=RTs/[(1-υρ)D] s：沉降系数；s=[dx/dt]/ω2x；把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，用S表示 υ：偏微比容；蛋白质溶于水0.74cm3/g D：扩散系??；cm2/s;二、 蛋白质分子大小与形状;二、 蛋白质分子大小与形状;凝胶过滤层析的工作原理;分子筛层析，Molecular-sieve chromatography; 凝胶过滤: Gel filtration chromato-graphy; 或 Gel retar-dation chromatography. ;根据公式计算分子量： logM=K1-K2Ve K1、K2为常数 Ve：洗脱体积 测定方法：测得几种标准蛋白质的Ve ，并以它们的分子量对数对作图得一条直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中查出它的分子量 待测样品可以不纯 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，可选用不同分离范围的凝胶。;;二、 蛋白质分子大小与形状;;二、 蛋白质分子大小与形状;二、 蛋白质分子大小与形状;;二、 蛋白质分子大小与形状;二、 蛋白质分子大小与形状;三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀;蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜 蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 ;蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 ;在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。;等电点沉淀法：改变溶液的pH值达到蛋白质的等电点使蛋白质分子失去净电荷 盐析法：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠）使蛋白脱去水化层而沉淀 有机溶剂沉淀法：加入一定量的极性有机溶剂，引起蛋白质脱去水化层而沉淀;在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。;加热沉淀：加热变性而凝固，等电点时，加热凝固最完全。加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露。 重金属盐沉淀：蛋白质在溶液的pH大于等电点时，带负电荷，容易和重金属离子形成不溶性沉淀。 生物碱和强酸碱沉淀：鞣酸、苦味酸、碘化钾、硝酸等易和蛋白质生成沉淀。;四、蛋白质分离提纯的一般原则;前处理要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态和生物活性。 动物组织和细胞用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理法破碎。 植物组织和细胞用石英砂和适当的提取液一起研磨破碎或用纤维素酶处理 细菌细胞的破碎用超声波振荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理，分解肽聚糖。 组织或细胞破碎以后选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。;如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分中，可以采用差速离心方法将它分开。 如果蛋白质和细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。 ;粗分级： 一般采用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离 这些方法的特点是简便、处理量大，可以除去杂质又能浓缩蛋白质溶液。 细分级： 凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等 电泳法，包括区带电泳、等电聚焦作为最后的提纯步骤 必要时结晶提纯;五、蛋白质混合物的分离方法;（一）根据分子大小不同的分离方法;超过滤是利用压力或离心力强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质截流在膜上 2.密度梯度