第六章 分子生物学研究方法(下)（修订版）.ppt

6. 3. 2 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system） 真核生物转录调控因子具有组件式结构（modular）特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录激活结构域（activation domain，AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 * BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 * 图6-17 酵母双杂交技术原理示意图 * 6. 3. 3 体外蛋白质相互作用技术 1、Far Western印迹技术 用32P标记的体外表达蛋白作探针,直接检测与该蛋白发生相互作用的蛋白或表达该蛋白的cDNA。 * 图6-18 Far Western印迹试验 * 2、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 * 图6-19 GST融合蛋白沉降技术流程。 * 3、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点 。 * Gong W. et al. (2008) Molecular Plant 1: 27-41. * 4、等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 * 图6-21 等离子表面共振技术示意图 * 5、免疫共沉淀技术(Co-IP) 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 * 免疫共沉淀示意图 * mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。 负对照，mRNA的同义链, 无杂交信号。 正对照，UBQ10 杂交信号遍布于整个胚珠。 * Expression pattern of BARD1 In Situ hybridization * * Han P, Li Q, Zhu YX. (2008) Mutation in the Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases WUSCHEL Expression from the Organizing Center. The Plant Cell 20: 1482-1493. * 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH). 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的位置。 * 人肌糖原磷酸酶基因在11号染色体的定位结果。 * 6. 1. 4 基因定点突变(site-directed mutagenesis). 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 * 图6-6 寡核苷酸介导的DNA突变技术 * 目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。 * 重叠延伸诱变法示意图 * 图6-8 大引物诱变法示意图 * 6. 2 基因敲除技术 6. 2. 1 基本原理 经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。 * 基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。 * 基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 * 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。 * 图6-9 用取代型（a）或插入型 （b）