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水牛角水溶性物质化学成分的研究 　　摘 要：通过研究水牛角中的水溶性物质的化学成分，来建立相应的分析鉴定方法。以shotgun蛋白质鉴定技术来研究水牛角中的蛋白质类物质，确定为角蛋白、胶原蛋白和桥粒蛋白等结构；以超滤系统和LC-Ms/Ms方法来鉴定水牛角中的肽类物质，确定为角蛋白与胶原蛋白的C末端肽段与非C末端肽段；通过对照，确定水牛角中的次黄嘌呤、尿苷、鸟苷及腺苷等四种核苷类物质。 　　关键词：水牛角 水溶性物质 蛋白质 肽类 鉴定方法 　　《名医别录》记载水牛角性味苦咸，具有清热解毒定惊之功效。水牛角在现代医学研究中，得出在解热、镇静等方面疗效突出。作为中医临床中采用药材，水牛角在治疗热病头痛、发斑发疹、出血、高热、小儿惊风及咽喉肿痛等病症中应用较广。从传统用法来看，水牛角无论是在单用或组方使用中，通常以水煎煮方式来提取，可见其水溶性物质是其功效的物质基础。现代医疗技术研究表明，在水牛角中含有多种水溶性物质，如蛋白质、氨基酸类、多肽类及核苷类等物质。当前的研究主要集中在水解氨基酸、无机元素及甾醇类小分子物质的分析，对水溶性大分子的研究还缺乏相应的鉴定方法。为此，我们从串联质谱技术运用中，结合shotgun技术来对水牛角中水溶性成分进行定性和定量分析，以获取快速鉴定的方法，并从质谱Ms/Ms图谱与数据库进行比对，确定水溶性物质中蛋白质或多肽的来源。 　　1 材料及设备 　　本例中所选用的水牛角药材来自淮安市某屠宰场，并符合《中国药典》（2010年版）鉴定标准要求；本例中对水牛角水提液的制备上，参照《中国药典》工艺，首先进行去角塞、洗净晾晒后破碎，将浓缩粉进行调制。本例中所用试剂主要有碳酸氢钠、十二烷基硫酸钠（SDS），二硫苏糖醇（DTT），以及胰蛋白酶（promega质谱测序级）；所用仪器主要有戴安U3000纳升液相系统，Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪，美国Merck Millipore公司的超滤系统，德国Sartorius公司的BP211D电子天平，美国Labconco公司的冷冻干燥机。 　　2 制备方法 　　对于水牛角水提液的制取，以水牛角粉加10倍量水进行煎煮，第一次煎煮10h，第二次煎煮8h，对两次煎煮滤液进行合并，以10000r?min-1离心取清液为水提液，进行冷冻干燥并保存。超滤分离方法借助于超滤系统，对水牛角水提液进行分段处理，以相对分子质量1000与3000为截留标准，对超滤膜分离后的水提液进行分段保存，即相对分子质量3000。在酶解过程中，首先秤取水提液冷冻干粉5mg，利用50mmol?L-1的碳酸氢钠溶液进行复溶，并加入胰蛋白酶（1%）进行反应，温度控制在37℃，24h后进行孵育5min（90℃），灭活后以10000r?min-1离心分离保留上清液备用。对于水牛角水溶性蛋白质、肽类的分离，采用戴安U3000纳升液相系统，以5μm色谱柱Reprosil C18AQ（75μmX150mm）来系统分析水牛角的不同样品。以样品5 μL流速为400nL?min-1中进行流动相测定，其中A相为乙腈-甲酸-水的比例为2：0.2：98；B相为乙腈-甲酸-水的比例为80：0.2：20，以2%-30%的B线性梯度洗脱60min。在进行肽段分析时对质谱仪喷雾电压设置为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；采用质谱一级全扫描m/z100-2000，分离宽度为3Da；在串联质谱分析中，以一级质谱数据的二级质谱扫描模式依此对离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离，得到相应的串联质谱。 　　本例采用的质谱数据库比对软件为Proteome Discoverer 1.3，以SEQuester搜库选择牛科下载数据库，检索前参数设置为：前体离子误差10ppm；子离子误差1Da；甲硫氨酸残基可变修饰（氧化+14.994Da）；半胱氨酸残基固定修饰（氨甲酰甲基化57.0215Da）；允许2个位点误差，假阳性率1%；在酶切方式选择上，不同水牛角水提液样品在酶切方法上选择为非酶切或胰蛋白酶酶切；其他参数选择默认；获得检索结果的分值（P0.05）具有显著性意义。在对核苷类化学成分进行分析时，首先对相对分子质量1000的水提液进行分析，色谱条件为Waters AcquityTM UPLC BEH C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm；柱温为30℃，流速为0.4mL?min-1；进样量为5μL；对于流动相的分析，采用甲醇（A）-水（B），洗脱速度为0-3min，5%A；3-15min，5%-30%A；15-17min，30%A。对质谱分析的条件设定为：ESI源，采用正离子模式进行扫描，3kV毛细管电压，在锥孔电压设定为30V，离子源温度设置为120℃，脱溶剂气温度为350℃，流量为600L?h-1，锥