气滞血瘀模型大鼠红细胞膜生物学的研究.doc

气滞血瘀模型大鼠红细胞膜生物学的研究 　　[摘要] 目的 从血液流变学和红细胞膜生物学变化探讨气滞血瘀证在红细胞膜上的生物学差异。 方法 20只Wistar大鼠，随机分为空白组及气滞血瘀组，每组10只。采用声光电等复合刺激对气滞血瘀组连续造模15 d后，取血测定血液流变学指标以及红细胞膜组分相关指标。 结果 与空白组比较，气滞血瘀组大鼠体重显著降低；全血黏度、血浆黏度和红细胞变形指数都有降低趋势但无显著性；APTT降低极显著（P 0.01）；PT、FIB和TT无显著变化；Na+-K+-ATP酶活力及SOD活力均显著降低（P 0.01，P 0.05）；唾液酸含量显著降低（P 0.05）；MDA含量显著升高（P 0.05）。 结论 气滞血瘀模型中红细胞膜上Na+-K+-ATP酶及SOD酶活力降低，并且唾液酸含量降低，但是全血黏度及红细胞变形性等未发生显著变化，但都有相应的趋势出现，可能是本实验中刺激强度较大但刺激时间略短造成的，也有可能和APTT等凝血机制有关，此模型有待进一步探索。 　　[关键词] 气滞血瘀；血液流变学；红细胞膜；生物学差异；血瘀证 　　[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0006-03 　　血瘀证是许多复杂性重大疾病过程中的常见证候，也是中西医结合研究最为活跃的领域之一。从20世纪60年代开始，中医药工作者就开始了血瘀证及活血化瘀治法的研究，随着科学技术的不断进步，人们对疾病的认识更加深入，有关血瘀证及活血化瘀治法的研究也不断深入，相关研究更加活跃[1]。本文从气滞血瘀这种公认的血瘀证动物模型入手，借助已建立的红细胞膜生物学特征研究平台，探求气滞血瘀证在红细胞膜上的生物学差异。今后将为方药活血化瘀机制的研究提供参考价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　清洁级Wistar老龄大鼠20只（15～17周龄），雌雄各半，体重 （263.0±12.9） g。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供（动物合格证号：SCXK（黑）2008004）。 　　1.2 仪器 　　Anthos2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司），BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD 2000（美国Alltech公司）。 　　1.3 试剂 　　甲醇（色谱纯，美国迪马技术有限公司），甲醇（分析纯，西陇化工股份有限公司），氯仿（分析纯，天津市化学试剂六厂分厂），胆固醇对照品（美国Sigma公司）。 　　1.4 方法 　　1.4.1 分组及模型的复制 　　20只Wistar大鼠随机分为2组，即气滞血瘀组和空白组，气滞血瘀组每天采用声光电复合刺激加钳尾方法复制血瘀模型，模拟气滞血瘀证[2-5]。将10只大鼠正式造模前1 d禁食不禁水，采用不可预知的慢性应激刺激方法进行干预，包括大鼠足底电击刺激10～12 h（电压在25～ 35 V，持续时间为60～120 s，每间隔8～ 15 分钟给予刺激1次）；噪声刺激10～12 h（噪音频率为5～15 KHz；强度等级为3；持续时间为60～120 s，每间隔8～15分钟给予刺激1次）；闪烁光刺激（频率为1～3 Hz；持续时间为60～120 s，每间隔8～15分钟给予刺激1次）。24 h光照与黑暗刺激（将大鼠日夜颠倒饲养，白天12 h置于暗室中；夜晚12 h置于日光灯下饲养）以及夹尾刺激10～12 h （以钳子夹大鼠的尾根至尾尖处，持续时间为60～120 s。每间隔8～15分钟给予刺激1次）。以上方法每5天为一个周期，不重复使用。如此连续操作15 d。末次造模后禁食不禁水12 h。次日以乌拉坦1 g/kg麻醉，固定，取血进行指标的测定。 　　1.4.2 红细胞膜的制备 　　取新鲜肝素抗凝血2 mL以及枸橼酸钠抗凝血6 mL。其中枸橼酸钠抗凝血以3000 r/min离心10 min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小板层，再以1∶3比例加入等渗pH 7.4 PBS，3000 r/min离心10 min，弃上清液，反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1∶80比例向红细胞中加入预冷的5 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl溶液[6]，同时加入0.1 mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲苯磺酰氟），超声15 min（80 Hz，20 ℃），放入4 ℃冰箱过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以15000 r/min离心10 min，弃上清液