可以透析法除去之.PPT

說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 表 3.1? 各種大小分子的色析法應用： 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 圖 3.4? 膠體過濾法的典型溶離圖譜： 介質粒子越細，色析法的解析力就越佳，但流動相的流速也就越慢。 介質粒子的大小，好像電視銀幕的解析度，粒子越小，解析力越好。粒子小可以降低粒子之間的空間，這些空間太大是降低解析力的原因之一 (見下圖)。 但因為粒子塞滿了所有空間，使得溶離液流過的速度變慢；流速太慢反而會導致解析力變差。 圖 3.3? 溶離液是以擴散方式進出膠體： 圖 3.3? 瀰散式膠體有較好的通透性： 上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。 粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。 若解析力差不多，儘快讓你要的蛋白質早點出來： 通常你都可以選擇多種膠體，但經常都是優劣互見。但若無特別考量，請選擇可讓你的蛋白質早一點流出來的膠體介質。當你要分別純化上圖紅色或青色兩個色帶時，你的選擇如何？實際去試試看，可能是最簡便的方法。 說明文字 圖 3.5? 液相層析管柱系統： 多練習膠柱的裝填，並注意所有預先設定的條件。 預先算準所需要的膠體，好好平衡在指定的緩衝液，並且把該膠體及管柱，事先保存在操作的溫度下；這樣的預備工作，幾乎已經成功一半了。 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 說明文字 實驗之前請仔細檢討並且把握住這些條件。 雖然理論的文字論述不能替代實際操作，但若能在操作之前後都有以上的考慮，則將會使成功機率大增。 其中，膠體『緊密裝填』可能是最重要的考慮因素。 說明文字 ■ 膠体過濾的溶離圖譜 A typical chromatogram X Y Z Enzyme activity NaCl Vo 之前不應有 物質溶離出來 Vt 之後不 應有物質 溶離出來 目標酵素 (E) 最好不要落在 主要蛋白質峰 (Y) 的範圍內 Elution Volume (mL) A Vo Ve Vt 0 E Juang RH (2007) EPA ■ 介 質 的 粗 細 影 響 解 析 力 Poor separation Peak flattened Best separation 0 50 100 0.5 1.0 1.5 Superfine Fine Coarse Ve/Vt 0 50 100 0 50 100 Relative amount Adapted from Pharmacia: Gil Filtration – Principles and Methods Bead size is critical to the resolution of gel chromatography Dispersion ■ 溶離液擴散進出膠球 Diffuse in and out bead 溶離液或樣本分子，由膠體粒子外圍均勻向內或外擴散。 Sample or buffer is diffusing in and then out of the gel particle. Diffusion Juang RH (2007) EPA ■ 溶離液對膠球的擴散或瀰散 Two types of gel 若膠體粒子太大，則由外圍擴散 到內部的距離長，通過粒子所需 要的時間拉長，降低分離效果。 Dispersion (瀰散) 方式的膠體 因通透性佳，溶離液可直接流 入膠體，不再靠擴散作用。 Small particle size reduces the diffusion time and increases the resolution of the gel Dispersion type gels let the sample molecules flow directly through the gel body, and have better resolution Juang RH (2007) EPA ■ 粒子粗細影響溶離液流動 Bead size vs flow rate 膠體的顆粒越小 其解析力越大 但流速變慢 Adapted from Scope RK (1987) Protein Purification – Principles and Practice p.192 Smaller particles also reduce the space between the beads, and prevent the