实验一--巨噬细胞吞噬功能实验.docxVIP

实验一 巨噬细胞吞噬功能实验1、【实验原理】 (1)巨噬细胞作为单核吞噬细胞系统的主要细胞，具有活跃的吞噬功能。能清除体内抗原物质及变性的细胞，在特异性及非特异性免疫中均起重要作用。MΦ受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明显增强。 (2)此实验采用体内法，即：在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠腹腔注射鸡红细胞30min后处死小鼠，取出腹腔液，以冷美蓝染色，油镜下计数吞噬鸡红细胞的百分数，及观察巨噬细胞中内因被杀死而染为蓝色的鸡红细胞的形态、数目，以判断巨噬细胞中的杀伤能力，由此间接地测定机体的非特异免疫水平。 2、【实验步骤】 （1）试验前3d，小白鼠腹腔注射6％无菌淀粉液1ml，诱导巨噬细胞渗出至腹腔中。（2）实验时，每只小鼠腹腔注射鸡红细胞液1ml，轻揉腹部，使红细胞在腹腔中分布均匀，利于吞噬（3）30min后，将小鼠拉颈处死，固定，打开腹腔暴露肠管，用吸管取出腹腔液，均匀涂布于载玻片上，然后再滴一小滴0.03％冷美蓝溶液，盖上盖玻片。（4）低倍镜下找到观察区域后，换高倍镜下进行观察，计数 3、【实验结果】 4、【结果分析】（1）如图所示，在小鼠体内诱导腹腔巨噬细胞产生后，再给小鼠注射鸡红细胞后镜检腹腔液，可观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，并且可以看到部分鸡红细胞聚集到吞噬细胞附近。 （2）镜下可见吞噬细胞核呈蓝色，被吞噬的鸡红细胞呈椭圆形，其胞浆呈红色而核被染成蓝色。 (3)由于未将腹腔液和冷美蓝溶液充分混合均匀，使得视野中出现大片深染区域。总体实验结果较好，视野中央可见清晰的吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞。 5、【注意事项】? （1）涂片的薄厚要适当，否则影响计数。 （2）小鼠腹腔注射时不要刺伤内脏。? （3）如小鼠腹腔液过少，可注入适量生理盐水。? （4）剪开小鼠腹腔时应避免出血，否则将影响试验结果。? （5）被吞噬的鸡红细胞时间过长可被消化，时间过短未被吞噬，必须掌握好吞噬作用时间。 实验二 双向琼脂扩散实验 1、【实验原理】 （1）可溶性抗原 与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀线/环的现象，称为沉淀反应 。 （2）琼脂扩散是指为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。当对应的抗原、抗体在半固体琼脂终相遇，且二者比例适当时，便出现可见的白色沉淀线，这组沉淀线是一组抗原、抗体的特异性复合物。当琼脂中有多组不同的抗原、抗体存在时，便各自依其扩散速度的差异，再适当的部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散不仅用于疾病的诊断，更广泛地用于抗原成分的分析。 （3）双向琼脂扩散试验是定性实验。将可溶性抗原与相应抗体分别加人琼脂板上的孔内，两者均可扩散，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。如果不是相应的抗原与抗体，就不出现沉淀线。本试验常用于分析抗原抗体的纯度及相互关系。 2、【实验步骤】 （1）制板：将熔化的1%琼脂加在玻片上，3ml/板。 （2）打孔：待琼脂凝固后，在板上打孔。 （3）加样：在空中加入相应抗原、抗体。 （4）结果观察 将琼脂板放入湿盒内置 37c 温箱中 24 小时后取出观察结果。 3、【实验结果】 4、【结果分析】 （1）如图所示，在中央孔与添加抗原1的孔之间出现沉淀线，有抗原抗体反应，为阳性反应，说明抗原1与抗体相对应。中央孔与添加抗原2的孔之间没有沉淀线，说明抗原2与抗体之间不相对应。? （2）抗体与抗原发生扩散时，随扩散距离的增大浓度降低，在抗原抗体比例适宜处形成可见的沉淀线。当有沉淀线出现时，说明有抗原抗体反应。? 5、【注意事项】（1）加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。 （2）反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。 （3）加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆，影响试验结果。 （4）试验前应做预试验，确定抗体的稀释度。