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益气去喘汤微生物限度检查的方法验证试验 　　[摘要]目的通过筛选合理的检查方法，为益气去喘汤提供正确的微生物限度检查标准。方法以据《中国药典》2015年版规定，分别采用常规法、平皿法、培养基稀释法对样品进行微生物限度试验。结果平皿法.对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均能达到要求；培养基稀释法（0.5mL/皿）对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率能达到要求；对大肠埃希菌、沙门菌的检查方法可使用常规方法进行检查。结论试验中选择的酵母菌、细菌、霉菌的计数方法，以及控制菌所选用的验证方法适用于益气去喘汤的微生物限度检查，本试验可达到检测目的。 　　[关键词]益气去喘汤；微生物限度检查；验证试验；制订检查标准 　　[中图分类号]R286.0 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2017）17-43-05 　　益气去喘汤是我院多年临床经验处方，主要由黄芪、党参、枇杷叶、前胡、桔梗、杏仁等药物组成的，具有益气、宣肺、化痰、平喘等功效，治疗肺气虚引起的哮喘、咳嗽等症状，疗效显著，安全可靠，无明显副作用。在制剂检验过程中，为保证微生物限度检查的科学性和准确性，以及确保本试验选择的检测方案适用于益气去喘汤中霉菌、酵母菌、细菌计数的检测，以及控制菌的检定，该验证方案采用《中国药典》2015年版一部附录XⅢc微生物限度检查方法进行验证试验，结果报道如下。 　　1试验材料 　　1.1试药 　　益气去喘汤由本院煎药室负责供应。 　　1.2试验所需的培养基 　　营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基等。上述所用的培养基均系北京三药科技开发公司生产。 　　1.3本试验所用菌种 　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]、白色念珠菌（Candida albicans）[cMCC（F）98001]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonellaparatyphi B）[CMCC（B）50094]。枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、白包念珠菌、乙型副伤寒沙门菌均由中国医学菌种保藏中心提供。 　　2试验验证步骤 　　2.1试验所用菌液的配制 　　2.1.1吸取在35℃经过24h培养的枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希菌的肉汤培养物1mL，使用0.9%无菌氯化钠溶液10倍量进行稀释，枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌至10-7、沙门菌至1@8，大肠埃希菌至10-7、大约50～100cfu/mL，以备试验使用。 　　2.1.2吸取在26℃经过24h培养的白色念珠菌液体培养物1mL，使用0.9%氯化钠无菌溶液10倍量进行稀释到10-5，大约50～100cfu/mL，以备试验使用。 　　2.1.3吸取在26℃经过7d培养的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠无菌溶液，洗脱掉孢子。再吸取出含孢子的混悬液，加0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化钠无菌溶液10倍量进行稀释到104，大约50～100cfu/mL，以备试验使用。 　　以上所使用的各株菌的培养物都是三代培养物。 　　2.2试验所用菌液的测定 　　2.2.1吸取以上枯草芽孢杆菌10-5、金黄葡萄球菌10-7、沙门菌10-8、大肠埃希菌10-7级稀释后的溶液的量分别为1mL，使用45℃营养琼脂培养基20mL分别注皿，并分别进行平行测定此二皿，调温至35%，静止48h后计算菌落数，大约50～100cfu/mL。测定的结果见表1。 　　2.2.2分别吸取以上配制的含黑曲霉104的孢子混悬溶液1mL、白色念珠菌10-5稀释溶液1mL，再取45℃玫瑰红钠琼脂培养基20mL分别进行注皿后，然后再分别平行测定此二皿，调温至26%，静止培养，每日观察，计算菌落数，大约50～100cfu/mL。测定的结果见表1。 　　2.3试验验证霉菌、酵母茵、细菌的计数方 　　依据《中国药典》2015年版一部（附录XⅢC）微生物限度检查法中计算菌落数的方法进行验证测定。试验所用供试溶液的配制：量取供试药液10mL，缓缓加入氯化钠一蛋白胨无菌缓冲溶液至100mL，调至pH7.0，用玻棒搅拌混合均匀，此为供试溶液备用。 　　2.3.1平皿法结果见表2～6。 　　2.3.1.1试验组 分别吸取上述供试溶液，按每个皿为1mL的量加入供试溶液，再加入上述已配制