盐酸小檗碱片微生物限度检查的方法学验证.docVIP

盐酸小檗碱片微生物限度检查的方法学验证 　　摘 要 目的：建立盐酸小檗碱片微生物限度检查的方法。方法：按《中国药典》2005版的要求［1］，通过接种代表性的阳性菌株，采用常规法、稀释法、薄膜过滤法进行方法学验证实验。结果：用PH7．0氯化钠-蛋白胨缓冲液每筒冲洗400mL（分四次），可以消除样品对五株阳性菌株的抑制作用。结论：[HTSS]本样品可以采用薄膜过滤法冲洗量为400 mL/筒进行微生物限度检查。? 　　关键词 盐酸小檗碱片 微生物限度检查 薄膜过滤法 方法学验证?? 　　 　　盐酸小檗碱片具有抑菌作用，临床用于痢疾杆菌、大肠杆菌引起的肠道感染。含抑菌成分的中成药进行微生物限度检查时，必须消除供试液抑菌活性，并通过实验验证该样品抑菌活性的消除，以保证检验结果的有效性。中国药典收载的各中成药品种检查项下，很少规定具体的微生物限度检查方法。本实验通过接种5种代表性的阳性菌株，经过微生物限度检查方法学的验证，建立了盐酸小檗碱片微生物限度检查的方法。? 　　 　　1 仪器与材料? 　　 　　1．1 仪器 HTY-2000A集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）；开放式一次性薄膜过滤器(北京牛牛基因技术有限公司,批号 ；SPX-100B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。? 　　1．2 样品 盐酸小檗碱片（云南天利药业有限公司，规格0．1g／片,批号20060312020060301）? 　　1．3 培养基和试剂 改良马丁液体培养基（批号，0507062 ），改良马丁琼脂培养基（批号，010315），玫瑰红钠琼脂培养基(批号, 030710), 营养肉汤培养基(批号, 011008)，营养琼脂培养基（批号，050328 ），胆盐乳糖培养基( 批号, 05222),北京三药科技开发公司;? 　　1．4 菌种 大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(F) 44102］、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ［CMCC(B) 63 501］、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ［CMCC(B) 26 003］、白色念珠菌(Candida albicans) ［CMCC(F) 98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F) 98 003 ］（中国药品生物制品检定所）? 　　 　　2 方法 按中国药典2005版微生物限度检查法（附录Ⅺ J）［2］ 进行验证试验? 　　 　　2．1 菌液制备 ? 　　取经34℃培养18-24h，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1 mL ,加入9 mL 0．9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5~10-7备用;取经24 ℃培养18~24h的白色念珠菌霉菌液体培养物1mL , 加入9 mL0．9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-6备用;取经培养一周的黑曲霉菌斜面物,加0．9%氯化钠溶液3mL, 洗下孢子,转移至另一空管,标准比浊后,取1 mL加入0．9%氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用。? 　　2．2 菌液的检验? 　　取上述金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠埃希菌10-5 ~10-7稀释液各1ml，用45℃营养琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，30～35℃培养48小时，计数，应约为50~100cfu/ml; 取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml，用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，23~28℃培养,逐日观察计数，应约为50~100cfu/ml。结果见表1。? 　　2．3 供试液制备：? 　　取样品10 克，加pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，混匀，取适量3000转/分离心10分钟作为1∶10的供试液。? 　　2．4 回收率的测定? 　　2．4．1 细菌数霉菌数常规法测定? 　　试验组：取1∶10供试液1 ml、50~100cfu 试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时逐日观察结果。? 　　菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数（同菌液检验）。? 　　供试品对照组：取1∶10供试液1 ml加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时逐日观察结果，测定供试品本底菌数。? 　　2．4．2 细菌数霉菌数稀释法测定? 　　试验组：取1∶10供试液0．2 ml/皿、50~100cfu 试验菌同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时逐日观察结果。? 　　菌液组：测定每一菌株所加的试验菌数（同菌液检验）。? 　　2．4．3 细菌数