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硒―汞双元素标记的策略识别硒蛋白多肽 　　摘 要 提出并发展了一种基于电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的双元素标签标记策略来选择性识别和检测硒蛋白/多肽，其中内源元素硒（Se）作为硒蛋白/多肽分子的识别元素，外源元素汞（Hg）作为硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子的区分元素。通过对硒代半胱氨酸（SeCys）和谷胱甘肽过氧化酶1（GPx1）两种模型分子的研究，外源邻羧基苯硫甲基汞（CH3Hg-THI）动态解离的CH3Hg+能够选择性标记硒代半胱氨酸残基（SeCys）中硒醇基（-SeH），但不能标记含硒蛋白/多肽分子的硒代蛋氨酸残基（SeMet）中的―SeCH3，进而依据Se和Hg的ICP-MS信号识别和检测硒蛋白/多肽。本方法应用于富硒酵母水溶性提取液的分析，结果表明，提取液中的硒蛋白/多肽能够被有效识别和检测，验证了Se-Hg双元素标签标记策略的发展是ICP-MS识别和检测硒蛋白/多肽的一种可行且优越的途径。 　　关键词 硒； 汞； 硒蛋白/多肽； 电感耦合等离子体质谱 　　1 引 言 　　以内源元素分析蛋白质已有很长的历史，130年前发明的凯氏定氮法（Kjeldahl method）就是利用检测蛋白质内源元素氮进行蛋白质分析的经典范例[1]。近二十年来，随着生命科学和分析技术的快速发展，针对生物分子（如蛋白质和多肽）的新元素标签标记研究策略和方法不断涌现，而且还在快速发展进程中[2]。具有优异的元素分析能力（高的灵敏度和选择性）的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）与元素标签策略的有机结合可以实现复杂生物体系中低丰度蛋白质和多肽等生物分子的分析[3～5]。除了内源元素标签，通过人为标记外源元素标签（如镧系元素、Hg、Au等）的研究策略因可以进一步扩展研究范围和弥补内源元素标签的不足，越来越受到重视[6～14]。但是，因为针对目标蛋白质/多肽如何建立起内源元素标签和外源标记元素间的关系还有一定困难，目前报道的研究方法还多集中于单一利用内源或外源元素，同时利用两类元素标签的研究工作还鲜有报道。内源和外源双元素标记识别策略的建立，需要满足以下要求：（1）目标生物分子需要含有内源性共价结合的标签元素；（2）目标生物分子能够被外源性元素标签有效标记，并且所标记的外源元素标签与内源标签元素应发挥各自的识别、区分和检测功能；（3）内源和外源性元素标签能够同时有效地被ICP-MS识别和检测。 　　在本课题组以前的研究工作中，不但利用内源元素硒（Se）定量地研究了人血浆中的硒蛋白，而且利用外源元素汞（Hg）标签对多种蛋白和多肽分子实现选择性的标记和定量分析[14～19]。Se和Hg是一对典型的在生物体中会产生拮抗效应的元素，并形成特定的硒汞化合物[20～22]。作为一类重要的生物分子，硒蛋白/多肽中Se以硒醇（―SeH）的形式存在于硒代半胱氨酸残基中，这为外源的Hg标签提供了一个理想的标记位点。利用这两种元素作为内源和外源元素标签识别和检测硒蛋白/多肽在理论上是可行的。本研究探讨了利用外源Hg标签标记硒蛋白/多肽的可能性，进而实现Se-Hg双元素标记选择性识别和检测硒蛋白/多肽的目的。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　液相色谱-电喷雾质谱（Esquire LC/ESI-IT-MS，德国布鲁克公司）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Microflex LRF MALDI-TOF-MS，德国布鲁克公司）；SERIES 200液相色谱-ELAN DRC II电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS，铂金埃尔默公司）。为了消除16O2+对32S+的干扰，在测定S时使用O2（99.999%，北京氦普北分气体工业有限公司）将S在动态反应池中氧化为SO（0.6 mL/min O2；RPQ 0.45），检测32S16O+测定S的含量；监测82Se+和202Hg+用于Se和Hg的测定。 　　硒代胱氨酸（Seleno-DL-cystine， （SeCys）2），硒代蛋氨酸（L-Selenomethionine， SeMet），二硫苏糖醇（Dithiol dithiothreitol， DTT），邻羧基苯硫酚（Thiosalicylic acid， HOOCC6H4SH），2，5-二羟基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid）和谷胱甘肽过氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1， GPx1）均购于美国Sigma-Aldrich 公司；氯化甲基汞（Methylmercuric chloride， CH3HgCl，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；富硒酵母（Sel-Plex，美国Alltech公司）；用于尺寸排阻色谱的标准物Pyruvate kinase （237.0