常见的RNAi、慢病毒、稳转细胞和原核表达简介.ppt

Novobio Custom Services Chaozheng.xie@ 1 第一部分 RNAi服务 2 RNA干扰现象是1990年由约根森（Jorgensen） 研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的研究中发现的 1998年，安德鲁·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀丽隐杆线虫（C.elegans） 中进行反义RNA抑制实验时发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或 反义RNA显示出了更强的抑制效果 RNAi干扰机理 3 长链 三种RNAi干扰技术手段 4 RNAi的应用 高通量的研究基因功能 基因敲除 基因治疗 基因表达调控 5 1.1 siRNA合成服务 化学合成的siRNA具有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。 6 偌百优势 siRNA oligo均由HPLC纯化，100％除去尚未配对的单链多种修饰选择：末端修饰（FAM，Biotin等），碱基修饰（2’-OMe） 7 化学合成优势 操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA有效片段的筛选。 服务流程 客户提供：siRNA oligo的序列信息或相应的靶基因信息（便于设计），以及技术要求（包括OD和nmols的精确数量、纯化类型、修饰要求等）根据序列信息，进行化学合成； HPLC纯化；经过分光光度计精确定量 冻干处理 我们提供：长度19-23碱基/链的siRNA，产品形式为退火的双链RNA的冻干粉，有以下选择 普通siRNA 化学修饰siRNA－利用2’-Fluoro或2’－OMe修饰以提高siRNA在血清和培养基中的稳定性；作用时间长于普通siRNA；荧光标记siRNA siRNA对照，包括普通阴性对照（与目的靶细胞中所有基因无同源性的阴性对照）、荧光标记的阴性对照（方便在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件）和siRNA阳性对照（作为一个实验系统检查，确保在实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的；常用的siRNA阳性对照有LaminA/C，Beta-Actin，P53，GAPDH等） 8 1.2 RNAi载体构建服务 使用RNAi载体的优势 实现瞬时或稳定的靶标抑制 在任何类型的细胞（甚至是难转染的细胞、原代细胞和非分裂细胞）中执行 RNAi 通过诱导型RNAi表达来调控基因抑制 选择稳定表达RNAi序列的纯细胞群 通过组织特异性启动子控制体内基因表达 9 三种载体构建方式 shRNA干扰载体构建： miRNA（microRNA）干扰载体构建 shRNAmir干扰载体构建 10 shRNA expression vectors  11 利用miRNA产生RNAi效果 诺百优势 质量保证：针对一个基因的不同位置设计4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。 多种平台载体可供选择：shRNA载体，miRNA干扰载体（第二代干扰载体），miR-shRNA载体（第三代干扰载体） 利用绿色荧光蛋白（GFP）和感兴趣的RNAi序列协同表达，方便追踪 可将多个RNAi序列串联到同一表达载体中并同时表达，进行多个靶基因的同时干扰 12 服务流程 客户提供：基因的Accession Number 针对特定基因，设计RNAi序列；合成该序列并退火生成双链DNA 将DNA与RNAi载体相连，连接物转化大肠杆菌 测定全长序列以鉴定序列的正确性；制备甘油菌 提供数据分析和报告给客户 我们提供：构建好的RNAi表达载体和相应的甘油菌 13 1.3 RNAi干扰服务 在RNAi研究中，测定敲除效率时，通过转染控制的最适化，可以获得高敲除效果。因此，为了将RNAi研究成功导入，需要对客户希望的细胞进行转染效率的最适化工作。我们采用实时荧光定量PCR或免疫蛋白印迹法分析这些RNA干扰序列对靶基因蛋白表达水平的抑制的有效性 14 诺百优势 质量保证：针对某靶基因设计的3条siRNA可保证其中两条的Knockdown效率达到70%（在转染效率大于80%的情况下）；针对某靶基因的4条miRNA序列，在转染效率80%的前提下，我们保证至少有2个克隆可以达到至少70%转录水平的knockdown。 可针对客户选择的靶细胞系，进行转染条件的优化服务，以确定所选择的细胞系的有效转染条件。 15 服务流程 客户提供 选择的细胞系和详细的细胞培养的操作步骤；选择的靶基因cDNA的序列号；抗体（如果需要Western blot检测）对需要用于转染的细胞进行细胞培养 对需要用于