子宫颈鳞癌组织中基质金属蛋白酶9表达的意义..docVIP

子宫颈鳞癌组织中基质金属蛋白酶9表达的 意义 ：孔灵玲，王学春，崔文，王旭，杨庆媛，宋希元， 姜晓刚，燕春艳 】 目的：探讨基质金属蛋白酶MMP 9与宫颈 鳞癌的发生、发展及转移的关系.方法：免疫组化SP法测定 MMP 9的表达及分布；明胶酶谱法测定活性型酮P 9蛋 白的含量;RT PCR技术检测丽P 9mRNA表迗水平.结果： 在宫颈鳞状上皮癌(SCC)组织和高度鳞状上皮内损害(H SIL) 中酮P 9蛋白的表达量均高于低度鳞状上皮内损害 (LSIL) (P 关键词】宫颈肿瘤；鳞状细胞癌；金属蛋白酶类; 肿瘤转移 0引言 宫颈癌发病率高，从低度鳞状上皮内损害(low gradesquamousi ntraepitheliallesi ons, LSIL)到高度鳞状 上皮内损害(high gradesquamo usintraepitheliall esions, HSIL)和原位癌(c arcinomasinsitu),然后到鳞状 上皮癌(squamousce 11 carcinomas, SCC)是一个连续的过程. 我们研究基质金属蛋白酶(matrixmetallopro tEinases MMPs)在宫颈癌的发生和发展过程中所起作用. 1材料和方法 材料宫颈癌活检组织84例取自我院1999 01/2002 12宫颈癌患者，年龄25?68岁.按国际妇产科联盟(FIGO) 1994 年修订的临床分期标准，LSIL(CINI)1 0例，HSIL(CINII，III) 21例，宫颈鳞癌53例.在宫颈鳞癌中I期14例，II期39例； 高分化11例，中分化17例，低分化25例；淋巴结转移23 例.手术时取肿瘤组织、癌旁组织、手术切缘及周围淋巴结. 抗醒P 9羊抗人多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒；丙烯 酰胺、甲叉双丙烯酰胺和明胶；Trizol试剂盒；引物由上海 生工生物工程公司合成. 方法 组织酮P 9表迗免疫组化及结果判定采用免疫组织 化学链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP法).一抗的工 作浓度为1 : 100;阴性对照组以PBS代替一抗.每个病例均 同时做HE染色和画P 9免疫组化.结果判定 ［1］， 以胞质或(和)胞膜出现棕黄色颗粒沉着为阳性表达.先按染 色强度打分：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色 3分；再按阳性细胞所占百分比打分：阳性细胞75%为4分. 将染色程度和阳性细胞百分比的乘积进行评分：0?4分为 (_)，5?8分为弱阳性(+)，9?12分为强阳性(). 组织酮P 9活性分析标本于液氮下粉碎、匀浆、离心， 取上清液以Centricon浓缩柱按体积比离心浓缩6倍，Bio Rad蛋白定量试剂盒定量、分装.取20uL上清液进行 聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，浓缩胶浓度50g/LpH，分离胶浓 度 100g/LpH 电泳后，凝胶于 5 Ommol/LTris HCl，5m mol/LCaC12,100mmol /LNaCl,25mL/LTritonX 100 中浸泡 振摇lh，中间换液1次，不含TritonX 100的洗液洗5min 后，再用 50mmol/L Tris 后，再用 50mmol/L Tris HC1,5mmol/LCa C12,200mmol/LNaCl，g/LNaN3, lOmL/LTrit onX 100 的孵育 液37°C条件下孵育18?24h，考马斯亮蓝R250染色，脱色， 干燥封胶.通过凝胶图像吸光度分析系统对结果进行灰度扫 描，以平均吸光度和杂交信号面积的乘积代表信号强度. 的引物序列为59mRNA的表达按Trizol试剂盒说明提取组织总RNA， 取上述RNA样品p g进行逆转录反应，反应体系为20 PL，反 应条件为37°Clh，95°C5min.取产物5uL进行PCR扩增， 丽P 9与内参照基因3 actin的引物共管扩增.MMP 的引物序列为5 GGTCCCCCCA CTGCTGGCCCTTCTACGG CC actin引物序列为5GTCCTCAGG GCACTGCAGGATGTCATA GGT 37 actin引物序列为5 CCGAATTCATCATG TTTGAGACCTTCAA MMP3及 5 CCGGATCCATCTCTT GCTCGAAGTCCA 3 MMP 9及3 actin预计扩增片段分别为638bp及326bp. PCR 参数为 94°C30s，55°C30s, 7 2°C30s. 30 个循环后，72°C延 伸5min.通过凝胶图像光密度分析系统对PCR产物电泳条带 进行灰度扫描，以INT和S的乘积代表信号强度，计算MMP 9与3 actin灰度值的比值作为酮P 9mRNA的相对表 达量. 统计学处理:采用软件分析系统进行非参数检验，以P2 结果 9的