实验六SSPAGE.doc

实验三 SDS 目的要求】 了解并掌握SDS电泳原理及方法。 掌握垂直板电泳的操作方法。 实验原理】 十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质 分子大小的差别分离蛋a质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理 主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关。 1凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成 的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋0质颗粒在电场中通过此凝胶吋 会受到阻碍。大分子蛋G质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋 白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。 2电荷效应：SDS是一种表面活性剂，在蛋白样品和凝胶中加入 SDS,则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层 SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超 过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差 别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间 的电荷差异消失。 3变性效应：SDS同时还破坏了蛋a质中的非共价键。导致蛋白质 变性，使sds-蛋a质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋o质 在SDS凝胶中的电泳迁移率不再受蛋G质原有电荷和形状的 影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS电泳吋，同 吋使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳完毕后根据标准分子量 大小得知样品蛋白质的相对分子量。 4凝胶对样品的浓缩效应：SDS使用一种不连续的缓冲系统, 即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓 冲液的pn值和离子强度也不相同。电泳吋，样品中的SDS-蛋白质复 合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分 离。 5.分子量测定原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS （十二烷基硫 酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多 肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达 到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD 到200KD之问时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符 合卜‘式：lgMW=K-bX,式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均 为常数，若将己知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的 电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 试剂器材】 1.30%凝胶贮备液称取30g丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺0.8g, 用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中，4°C冰箱保 存。 10%凝胶贮备液称取10g丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺 0.5g,用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中4°C 冰箱保存。 10%SDS用去离子水配制，贮存于室温中。 1%TEMED （N，N，N，N’ -四甲基乙二胺）。 10%过硫酸铵用去离子水在临用前配制。 Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH 8.3）: Tris 6.0g 甘氨酸 28.8g 10%SDS溶液 10 ml 用蒸馏水定容至 1000ml 1.5mol/LpH8.8Tris-HCl 缓冲液：称取Tris 181.7g，加适量蒸 馏水溶解，用浓HC1调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000ml （500ml）。 1.0 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液称取Trisl21.1g，加500ml 蒸馏 水溶解，用浓HC1调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000 ml。（500ml） 0.05mol/L pH 8.0 Tris-HCl 缓冲液称取Tris6.1g，加500ml 蒸馏 水溶解，用浓HC1调节pH值至8.0,加蒸馏水至1000 ml。（只需要 100ml) .2x样品缓冲液： 蔗糖 4g 溴酚蓝 2mg 10%SDS 2ml 5% p-巯基乙醇 0.5ml 0.05mol/L Tris-HCl, pH 8.0， 2ml 用蒸馏水定容至10.0ml 0.25%考马斯亮蓝R250 将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450 ml甲醇中，再加入450ml蒸馏水和100ml冰乙酸，混匀过滤除去颗 粒物质。 洗脱液将50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中混 匀。 预染蛋白质分子量标准:117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD 共6种蛋白质 电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加 样器等。 操作步骤】 1制备凝胶 ⑴准备玻璃板，洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好，按下表配制12%分离胶溶 液。 浓缩胶和分离胶的配置 5%浓缩胶的配置 各组分名称 各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量 1ml 2ml 3ml