茭白黑粉菌脉冲电泳分析的方法.docVIP

茭白黑粉菌脉冲电泳分析的方法 　　摘要：采用脉冲电泳法对茭白黑粉菌染色体进行核型分析。分析结果表明，茭白黑粉菌脉冲电泳样品处理方法包括原生质体的制备、电泳参数的设置等，对试验结果有一定影响，在制备电泳样品时，包埋的原生质体或孢子的浓度不能太低，蛋白酶K的浓度不能过高，低熔点琼脂糖的浓度不能太低，此外还应确保电泳槽水平，并且电泳结束后及时取出凝胶。 　　关键词：茭白黑粉菌；原生质体；脉冲电泳；核型分析 　　 　　在茭白（ZizanialatifoliaTurcz.）生长期间，茭白黑粉菌（UstilagoesculentaP．Henn.）与茭白植株共生，并在茭白植株体内分泌代谢产物刺激茭白茎基部膨大形成肉质茎[1]。茭白黑粉菌诱导茭白茎膨大的机制目前还不清楚，主要与茭白黑粉菌和植株互作的分子机制研究缺少有关，因此，深入研究其分子生物学特性亟待进行。 　　核型是指动物、植物、真菌等真核生物的某一个体或某一分类群的细胞内染色体组中染色体的数目、大小和形态[2]。明确基因组染色体数目和大小是基因组分析的基础工作，对搞清基因组DNA的全部核苷酸顺序结构，识别所有基因的编码，测定基因的位置及它们的功能有重要意义，是分子生物学乃至整个生命科学领域一项十分重要的基础性工作[3]。 　　由于真菌染色体较小以及可能获得的遗传标记较少，因此难以用传统的染色体技术和光学显微镜观察或通过基因间建立遗传学连锁关系的方法对其进行测定。脉冲电泳技术可分离大分子量的DNA的极限为10Mb，为真菌染色体的研究提供了技术平台[4]。脉冲电泳广泛用于真菌的核型分析，通过它可以直接得到真菌染色体的数目，每条染色体分子量以及染色体总量。本方法参考了多位前人脉冲电泳的方法，采用改进的脉冲电泳法对茭白黑粉菌染色体组进行核型分析。 　　1材料与方法 　　1.1材料准备 　　取已分离、纯化的茭白黑粉菌单孢菌落，接 　　种于液体培养基中，在28℃，180r/min条件下摇瓶。培养48h后，将培养基倒入50mL离心管中， 　　10000r/min离心10min，收集孢子。 　　液体培养基：蔗糖10g，葡萄糖10g，L-Asp2g，马铃薯200g，水1000mL。按照各物质使用浓度要求加入青霉素、链霉素、维生素B1。 　　1.2主要试剂及仪器 　　STC缓冲液：0.05mol/LTris-His（pH=8.0）， 　　0.05mol/LCaCl2，0.8mol/L山梨醇；酶液：用0.7mol/LNaCl配制10mg/mL溶解酶（Sigma）+10mg/mL崩溃酶（Sigma）+10mg/mL蜗牛酶（北京拜尔迪生物技术有限公司）的混合酶液后，8800r/min离心，上清液用直径0.22μm过滤器过滤除菌，现配现用。 　　蛋白酶K缓冲液：100mmol/LEDTA（pH=8.0）、1%月桂酰肌氨酸、0.2%脱氧胆酸钠、1mg/mL蛋白酶K[5]。 　　SCE缓冲液：1mol/L山梨醇，20mmol/L柠檬酸钠（pH=5.8），10mmol/LEDTA。 　　低熔点琼脂糖、蛋白酶K、Tris、EDTA、溴化乙锭、高强度琼脂糖、月桂酰肌氨酸、脱氧胆酸钠均购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其他试剂均为分析纯。 　　主要仪器有水平摇床、低温离心机、具有AxiocamCCD摄像头和Axiovision数字成像软件（AxioVisionSoftwareRelease3.1.，CarlZeissVisionImagingSystems）的ZeissAxiophot2显微镜、电泳系统（Bio-RadCHEFMapper）、数码凝胶成像系统（Fine-doX3）。 　　1.3茭白黑粉菌原生质体的获得 　　①将离心收集到的孢子用无菌水振荡、离心洗涤2次。再用0.7mol/LNaCl溶液振荡、离心洗涤1次。 　　②尽量倒干水分，加入酶液（菌体∶酶液=1g∶ 　　10mL），摇动以混合均匀。30℃，100r/min酶解3h[6]。30min后观察有无原生质体释放，以后每隔30min观察1次。 　　③酶解后的原生质体用4层擦镜纸过滤，过滤前先用STC缓冲液润湿擦镜纸，过滤完后用STC缓冲液冲洗擦镜纸。 　　④将收集到的滤液4000r/min，4℃离心10min，移液枪吸取上清，检查是否有原生质体。若上清有原生质体，再次离心。至上清无原生质体时，弃上清，收集沉淀的原生质体。分别用0.7mol/LNaCl溶液和STC缓冲液离心洗涤收集到的原生质体1次。 　　⑤向离心收集的原生质体中加入1mLSTC缓冲液，轻轻混合均匀，用血球计数板计数。用STC缓冲液调至原生质体浓度大约为108个/mL，然后立即42℃预热备用或加甘油于-80℃冰箱中保存。 　　1.4电泳样品准