基因诊断教程教案.ppt

（三） β-地贫的基因诊断 1. DN检测与分析 ： ① PCR+ASO 探针法 为主要方法 根据 β-珠蛋 白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生 突变的2个片段,再分别与相应野生型探针和突 变探针进行斑点杂交。 ② PCR+RFLP连锁分析法 检测与β-珠蛋白基因连 锁的遗传标记进行基因诊断,如β-珠蛋白5’端 有一限制内切酶HgiAI的多态性位点,在中国人 群的频率为0.5 ③ DNA芯片技术 2.RNA检测与分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以助诊 断 二.杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD) DMD：是性连锁隐性遗传病,是由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因突变(突变或缺失). 其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引起无力和挛缩。DMD相对更为常见。DMD患儿在5岁前发病，20岁左右由于心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500 。 杜氏肌营养不良症的基因诊断 RFLP连锁分析:通过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁的DNA多态性,并将其作为遗传标记追踪多态性在家族成员中的传递. 基因组DNA探针法: 用突变高发区的常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因的相应变异. cDNA探针法:用较短的抗肌萎缩蛋白基因cDNA作为探针.比2方便、检出率高. 多重PCR法:对基因突变较集中的区域,设计多对引物,扩增基因相应的突变高发区,检测相应的基因突变. 第四节 用基因诊断技术检测肿瘤 肿瘤的发生涉及多个基因、多种因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略. 一.通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 淋巴造血系统肿瘤: 染色体易位及基因融合 是较普遍的现象. 如:淋巴瘤和淋巴结反应性 增生.它是由于T细胞受体(TCR)基因和IgH基 因重排,使原来相隔数百个碱基的IgH和TCR 基因的V区和J区靠近在一起.用PCR扩增该区 域片段,通过长度分析就能判断是否发生了 基因重排. 二.通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤 癌基因的激活及抑癌基因的失活与肿瘤的发生密切相关.大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和(或)抑癌基因的突变 1.癌基因-ras与肿瘤: ras是肿瘤中最常被激活的癌基因.激活的分子机制主要是点突变,高发区是第12 、13和61位密码子.如90%的胰腺癌,50%的结直肠癌和1/3的肺腺癌都在是K-ras基因第12位密码子突变. ras癌基因点突变检测方法: a.PCR-ASO法:检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点； 但点突变的检出仅限于寡核苷酸探针的探测位点和突变类 型。 b.PCR-SSCP法：根据PCR扩增的目标DNA片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便； 缺点：不能检测出突变的具体位点和具体类型。 通过检测癌基因和抑癌基因诊断肿瘤（续） 2 .P53基因与肿瘤：p53基因是最常被失活的抑癌基 因，失活的分子机制主要是基因突变，也有因为基 因表达异常而使p53失活，约50%以上的恶性肿瘤有 p53基因突变。 突变类型：130?290密码子间常发生点突变，也有少量的插入或缺失突变。 基因检测方法：① PCR-SSCP:可检出有无突变 ② PCR-RFLP:通过内切酶位点的消 失或增加检测p53的基因突变。 三.通过检测肿瘤相关病毒诊断肿瘤 已经发现多种病毒与肿瘤的发生有关，它们有DNA病毒，也有RNA病毒,其中逆转录病毒(retro-virus)对动物细胞的致瘤作用已得到公认.还发现一些与人肿瘤发生有关的病毒如: Burkitt 淋巴瘤 人类乳头瘤病毒(HPV) 宫颈癌 通过检测这些病毒的基因就可以帮助诊断相应的肿瘤. EB病毒 四.通过检测肿瘤标记物基因或mRNA诊断肿瘤 肿瘤标志物（tumor marker)是由肿瘤组织细胞产生的，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。 类型：基因标志：是指基因本身突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。基因表型标志：基因产物表达和调控异常，表现为所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，一般出现较晚。 基因诊断方法： ① 基因变异导致肿瘤标记物的产生或含量改变，可选择：PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-测序，PCR-SSCP等技术。 ②导致肿瘤标记物产生或含量改变分子机制不清楚，